Polimeraz zəncir reaksiyası

Polimeraz zəncir reaksiyası (PZR) (ing. polymerase chain reaction, PCR) Patoloji mikroorqanizmlərin ( virus, bakteriya, göbələk, parazit) təyin edilməsində geniş istifadə olunan mikrobioloji müayinə metodudur. Mikrobiologiya laboratoriyalarında geniş istifadə edilir. — biokimya və molekulyar biologiya sahələrində DNTnin, E.coli və ya maya kimi hərhansı bir canlı orqanizm istifadə edilmədən sadəcə ferment vasitəsilə külli miqdarda çoxaldılması üçün istifadə edilən metoddur. PZR çağdaş genetik mühəndisliyinin əsas metodlarından biri sayılır və molekulyar genetikanın inkişafında böyük rol oynamışdır. Kari Mullis tərəfindən 1983-cü ildə icad edilən metod, ona Nobel mükafatını qazandırıb.

Əsas prinsip

PZR üçün termik dövr cihazı

Metod DNT-nin müəyyən region və ya regionlarının süni şəraitdə (orqanizmdən kənarda)(in vitro) DNT polimeraz fermenti vasitəsilə müəyyən nahiyəni seçərək təkrar təkrar kopyalanması prinsipinə əsaslanır. Adətən PZR metodu ilə 10 kb (kilo əsas cütü) böyüklüyə qədər DNT çoxaltmaq mümkündür, ancaq bəzi metodlar 40 kb uzunluqda hissənin çoxaldılmasına belə imkan verir.

PZR-in tətbiqi

Ən sadə PZR metodunun tətbiqi üçün aşağıdaki komponentlər lazımdır:

• İçində çoxaldılmaq istənilən regionu saxlayan DNT.
• Regionun sonlarına tamamlayıcı olan iki növ praymer.
• İstiliyə davamlı DNT polimeraz fermenti.
• Dörd növ dezoksiribonukleotid fosfat (A, G, C, T)
• Fermentin çalışması üçün optimal şərait yaradan bufer məhlulu.
• Divalent kation, {adətən maqnezium ancaq manqan da istifadə oluna bilər}.

Reaksiya 0,2-0,5 millilitrlik plastik qabcıqlar içərisində 15-100 mikrolitr həcmə malik PZR cihazında aparılır. Cihaz reaksiyanın gedişatı üçün önəmli olan dəqiqliyi ən az 0,1°С olan isitmə və soyutma dövrlərini təmin edir.

PZR reaksiyası üç mərhələdən ibarətdir.

1. Denaturasiya (96°) - DNT molekulunu əmələ gətirən iki ədəd DNT zənciri yüksək temperatura məruz qalaraq bir-birindən ayrılır.
2. Praymer bağlama (55°) - Reaksiya üçün lazım olan praymer cütündən her biri DNT nin ucuna tamamlayıcı olur. Praymerler istənilən nöqtələrə bağlanılır.
3. Primer uzatma(72°) - DNT hissələri təkrar istiliyə məruz qalaraq uzadılır. Bunun üçün istiliyə davamlı xüsusi DNT polmeraza fermenti (tag polimeraza - bakteriya növü) istifadə edilir. Primere bağlı haldakı polimerazanin nukleotidleri uc uca bağlanaraq yeni bir DNT zənciri əmələ gətirir.

Polimeraza zincir reasiyasi bu üç addımdan ibarətdir. Çoxaldilacaq DNT lerin miqdarından asılı olaraq bu üç addım bir neçə dəfə təkrarlanır. Döngü ortalama 35 dəfə təkrarlanır. Bu isə minlərcə yeni DNT zəncirinin yaranması deməkdir. Bir nümunənin bu qədər çoxaldilmasi təxmini 2-3 saat çəkir.

Praymerlər

Praymer 13-30 nükleotid uzunluğunda PZR-in spesifikliyini müəyyən edən sintetik DNT parçasıdır. Reaksiya üçün lazım olan praymer cütünün hər biri matriksə DNT-nin 3' ucuna tamamlayıcı olur.