Hromatinska imunoprecipitacija (ChIP) je tip imunoprecipitacijske eksperimentalne tehnike koja se koristi za istraživanje interakcije između proteina i DNK u ćeliji. Cilj mu je utvrditi da li su specifični proteini povezani sa specifičnim genomskim regijama, kao što su transkripcijski faktori na promotoru ili druga mjesta vezanja DNK, i eventualno definiranje cistrona. ChIP takođe ima za cilj da odredi specifičnu lokaciju u genomu sa kojom su povezane različite histonske modifikacije, što ukazuje na cilj modifikatora histona.[1] ChIP je ključan za napredak u polju epigenomike i učenje više o epigenetičkim fenomenima.[2]
Ukratko, konvencijski metod je sljedeći:
Postoje uglavnom dva tipa ChIP-a, koje se prvenstveno razlikuju u početnoj pripremi hromatina. Prvi koristi reverzibilno unakrsno-vezani hromatin srezan pomoću sonikacije koji se zove umreženi ChIP (XChIP). Nativni ChIP (NChIP) koristi prirodni hromatin srezan putem mikrokokusne nukleazne razgradnje.
Umreženi ChIP je uglavnom prikladan za mapiranje DNK mete transkripcijskih faktora ili drugih proteina povezanih s hromatinom i koristi reverzibilno unakrsno-povezani hromatin kao početni materijal. Sredstvo za reverzibilno umrežavanje može biti formaldehid[3] ili UV svjetlost.[4] Zatim se umreženi hromatin obično reže ultrazvukom, dajući fragmente dužine 300–1000 baznih parova (bp). Za smicanje hromatina korišteno je blago formaldehidno umrežavanje, praćeno digestijom puten nukleaza.[5] Fragmenti hromatina od 400 – 500 bp pokazali su se pogodnim za ChIP testove jer pokrivaju dva do tri nukleosoma.
Ćelijski ostaci u pomaknutom lizatu se zatim uklanjaju sedimentacijom i kompleksi protein-DNK se selektivno imunoprecipitiraju upotrebom specifičnih antitijela na protein(e) od interesa. Antitijela se obično spajaju na agarozu, sefarozu ili magnetne kuglice. Alternativno, kompleksi hromatin-antitijelo mogu se selektivno zadržati i eluirati inertnim polimernim diskovima.[6][7] Imunoprecipitirani kompleksi (tj. kompleks zrna–antitijelo–protein–ciljna sekvenca DNK) se zatim sakupljaju i ispiru kako bi se uklonio nespecifično vezani hromatin, preokreće se protein–DNK unakrsna veza i proteini se uklanjaju probavom proteinazom K. Verzija proteina od interesa sa oznakom epitopa ili biotinilacija in vivo[8] mogu se koristiti umjesto antitijela na nativni protein od interesa.
DNK povezana s kompleksom se zatim pročišćava i identificira lančanom reakcijom polimeraze (PCR), mikronizovima (čIp-na-čip), molekulskim kloniranjem i sekvenciranjem ili direktnim visooprotočno sekvenciranje
Nativni ChIP je uglavnom pogodan za mapiranje DNK mete histonskih modifikatora. Općenito, prirodni hromatin se koristi kao početni hromatin. Dok se histoni omotaju oko DNK i formiraju nukleosome, oni su prirodno povezani. Zatim se hromatin smješta razgradnjom mikrokoknih nukleaza, koje cijepaju DNK po dužini povezivača, ostavljajući nukleosome netaknutim i osiguravajući fragmente DNK dužine od jednog (200bp) do pet nukleosoma (1000bp). Nakon toga, metode slične XChIP-u koriste se za čišćenje ćelijskih ostataka, imunoprecipitaciju proteina od interesa, uklanjanje proteina iz imunoprecipitiranog kompleksa i pročišćavanje i analizu DNK povezane s kompleksom.
Tabela 1: Prednosti i nedostaci NChIP i XChIP
XChIP | NChIP | |
---|---|---|
Prednosti | Pogodno za faktore transkripcije ili bilo koje druge proteine povezane s hromatinom koji se slabo vezuju. Primjenjivo na sve organizme gdje je prirodni protein teško pripremiti |
Testabilna specifičnost antitela Bolja specifičnost antitijela kao ciljni protein prirodno netaknut Bolja efikasnost oporavka hromatina i proteina zbog bolje specifičnosti antitijela |
Nedostaci | Neefikasan oporavak hromatina zbog poremećaja epitopa ciljnog proteina antitijela Može uzrokovati lažno pozitivan rezultat zbog fiksacije prolaznih proteina na hromatin Širok raspon veličine smicanja hromatina zbog nasumičnih rezova ultrazvukom. |
Obično nije prikladno za nehistonske proteine Nukleosomi se mogu preurediti tokom probave |
Šablon:Imunološke tehnike i testovi
Hromatinska Imunoprecipitacija (ChIP) je tip imunoprecipitacija imunoprecipitacijske eksperimentalne tehnike koja se koristi za istraživanje interakcije između proteina i DNK u ćeliji. Cilj mu je utvrditi da li su specifični proteini povezani sa specifičnim genomskim regijama, kao što su transkripcijski faktori na promotoru ili druga mjesta vezanja DNK, i eventualno definiranje cistrona. ChIP takođe ima za cilj da odredi specifičnu lokaciju u genomu sa kojom su povezane različite histonske modifikacije, što ukazuje na cilj modifikatora histona.[1] ChIP je ključan za napredak u polju epigenomike i učenje više o epigenetičkim fenomenima.[2]
Ukratko, konvencijski metod je sljedeći:
Postoje uglavnom dva tipa ChIP-a, koje se prvenstveno razlikuju u početnoj pripremi hromatina. Prvi koristi reverzibilno unakrsno-vezani hromatin srezan pomoću sonikacije koji se zove umreženi ChIP (XChIP). Nativni ChIP (NChIP) koristi prirodni hromatin srezan putem mikrokokusne nukleazne razgradnje.
Umreženi ChIP je uglavnom prikladan za mapiranje DNK mete transkripcijskih faktora ili drugih proteina povezanih s hromatinom i koristi reverzibilno unakrsno-povezani hromatin kao početni materijal. Sredstvo za reverzibilno umrežavanje može biti formaldehid[3] ili UV svjetlost.[4] Zatim se umreženi hromatin obično reže ultrazvukom, dajući fragmente dužine 300–1000 baznih parova (bp). Za smicanje hromatina korišteno je blago formaldehidno umrežavanje, praćeno digestijom puten nukleaza.[5] Fragmenti hromatina od 400 – 500 bp pokazali su se pogodnim za ChIP testove jer pokrivaju dva do tri nukleosoma.
Ćelijski ostaci u pomaknutom lizatu se zatim uklanjaju sedimentacijom i kompleksi protein-DNK se selektivno imunoprecipitiraju upotrebom specifičnih antitijela na protein(e) od interesa. Antitijela se obično spajaju na agarozu, sefarozu ili magnetne kuglice. Alternativno, kompleksi hromatin-antitijelo mogu se selektivno zadržati i eluirati inertnim polimernim diskovima.[6][7] Imunoprecipitirani kompleksi (tj. kompleks zrna–antitijelo–protein–ciljna sekvenca DNK) se zatim sakupljaju i ispiru kako bi se uklonio nespecifično vezani hromatin, preokreće se protein–DNK unakrsna veza i proteini se uklanjaju probavom proteinazom K. Verzija proteina od interesa sa oznakom epitopa ili biotinilacija in vivo[8] mogu se koristiti umjesto antitijela na nativni protein od interesa.
DNK povezana s kompleksom se zatim pročišćava i identificira lančanom reakcijom polimeraze (PCR), mikronizovima (čIp-na-čip), molekulskim kloniranjem i sekvenciranjem ili direktnim visooprotočno sekvenciranje
Nativni ChIP je uglavnom pogodan za mapiranje DNK mete histonskih modifikatora. Općenito, prirodni hromatin se koristi kao početni hromatin. Dok se histoni omotaju oko DNK i formiraju nukleosome, oni su prirodno povezani. Zatim se hromatin smješta razgradnjom mikrokoknih nukleaza, koje cijepaju DNK po dužini povezivača, ostavljajući nukleosome netaknutim i osiguravajući fragmente DNK dužine od jednog (200bp) do pet nukleosoma (1000bp). Nakon toga, metode slične XChIP-u koriste se za čišćenje ćelijskih ostataka, imunoprecipitaciju proteina od interesa, uklanjanje proteina iz imunoprecipitiranog kompleksa i pročišćavanje i analizu DNK povezane s kompleksom.
Tabela 1 Prednosti i nedostaci NChIP i XChIP
XChIP | NChIP | |
---|---|---|
Prednosti | Pogodno za faktore transkripcije ili bilo koje druge proteine povezane s hromatinom koji se slabo vezuju. Primjenjivo na sve organizme gdje je prirodni protein teško pripremiti |
Testabilna specifičnost antitela Bolja specifičnost antitijela kao ciljni protein prirodno netaknut Bolja efikasnost oporavka hromatina i proteina zbog bolje specifičnosti antitijela |
Nedostaci | Neefikasan oporavak hromatina zbog poremećaja epitopa ciljnog proteina antitijela Može uzrokovati lažno pozitivan rezultat zbog fiksacije prolaznih proteina na hromatin Širok raspon veličine smicanja hromatina zbog nasumičnih rezova ultrazvukom. |
Obično nije prikladno za nehistonske proteine Nukleosomi se mogu preurediti tokom probave |
<ref>
;
nije naveden tekst za reference s imenom Rosenfeld P122, 1756–8935–6-S1-P122
<ref>
;
nije naveden tekst za reference s imenom Viens A 2004 68–76
Šablon:Imunološke tehnike i testovi
Hromatinska Imunoprecipitacija (ChIP) je tip imunoprecipitacija imunoprecipitacijske eksperimentalne tehnike koja se koristi za istraživanje interakcije između proteina i DNK u ćeliji. Cilj mu je utvrditi da li su specifični proteini povezani sa specifičnim genomskim regijama, kao što su transkripcijski faktori na promotoru ili druga mjesta vezanja DNK, i eventualno definiranje cistrona. ChIP takođe ima za cilj da odredi specifičnu lokaciju u genomu sa kojom su povezane različite histonske modifikacije, što ukazuje na cilj modifikatora histona.[1] ChIP je ključan za napredak u polju epigenomike i učenje više o epigenetičkim fenomenima.[2]
Ukratko, konvencijski metod je sljedeći:
Postoje uglavnom dva tipa ChIP-a, koje se prvenstveno razlikuju u početnoj pripremi hromatina. Prvi koristi reverzibilno unakrsno-vezani hromatin srezan pomoću sonikacije koji se zove umreženi ChIP (XChIP). Nativni ChIP (NChIP) koristi prirodni hromatin srezan putem mikrokokusne nukleazne razgradnje.
Umreženi ChIP je uglavnom prikladan za mapiranje DNK mete transkripcijskih faktora ili drugih proteina povezanih s hromatinom i koristi reverzibilno unakrsno-povezani hromatin kao početni materijal. Sredstvo za reverzibilno umrežavanje može biti formaldehid[3] ili UV svjetlost.[4] Zatim se umreženi hromatin obično reže ultrazvukom, dajući fragmente dužine 300–1000 baznih parova (bp). Za smicanje hromatina korišteno je blago formaldehidno umrežavanje, praćeno digestijom puten nukleaza.[5] Fragmenti hromatina od 400 – 500 bp pokazali su se pogodnim za ChIP testove jer pokrivaju dva do tri nukleosoma.
Ćelijski ostaci u pomaknutom lizatu se zatim uklanjaju sedimentacijom i kompleksi protein-DNK se selektivno imunoprecipitiraju upotrebom specifičnih antitijela na protein(e) od interesa. Antitijela se obično spajaju na agarozu, sefarozu ili magnetne kuglice. Alternativno, kompleksi hromatin-antitijelo mogu se selektivno zadržati i eluirati inertnim polimernim diskovima.[6][7] Imunoprecipitirani kompleksi (tj. kompleks zrna–antitijelo–protein–ciljna sekvenca DNK) se zatim sakupljaju i ispiru kako bi se uklonio nespecifično vezani hromatin, preokreće se protein–DNK unakrsna veza i proteini se uklanjaju probavom proteinazom K. Verzija proteina od interesa sa oznakom epitopa ili biotinilacija in vivo[8] mogu se koristiti umjesto antitijela na nativni protein od interesa.
DNK povezana s kompleksom se zatim pročišćava i identificira lančanom reakcijom polimeraze (PCR), mikronizovima (čIp-na-čip), molekulskim kloniranjem i sekvenciranjem ili direktnim visooprotočno sekvenciranje
Nativni ChIP je uglavnom pogodan za mapiranje DNK mete histonskih modifikatora. Općenito, prirodni hromatin se koristi kao početni hromatin. Dok se histoni omotaju oko DNK i formiraju nukleosome, oni su prirodno povezani. Zatim se hromatin smješta razgradnjom mikrokoknih nukleaza, koje cijepaju DNK po dužini povezivača, ostavljajući nukleosome netaknutim i osiguravajući fragmente DNK dužine od jednog (200bp) do pet nukleosoma (1000bp). Nakon toga, metode slične XChIP-u koriste se za čišćenje ćelijskih ostataka, imunoprecipitaciju proteina od interesa, uklanjanje proteina iz imunoprecipitiranog kompleksa i pročišćavanje i analizu DNK povezane s kompleksom.
Tabela 1 Prednosti i nedostaci NChIP i XChIP
XChIP | NChIP | |
---|---|---|
Prednosti | Pogodno za faktore transkripcije ili bilo koje druge proteine povezane s hromatinom koji se slabo vezuju. Primjenjivo na sve organizme gdje je prirodni protein teško pripremiti |
Testabilna specifičnost antitela Bolja specifičnost antitijela kao ciljni protein prirodno netaknut Bolja efikasnost oporavka hromatina i proteina zbog bolje specifičnosti antitijela |
Nedostaci | Neefikasan oporavak hromatina zbog poremećaja epitopa ciljnog proteina antitijela Može uzrokovati lažno pozitivan rezultat zbog fiksacije prolaznih proteina na hromatin Širok raspon veličine smicanja hromatina zbog nasumičnih rezova ultrazvukom. |
Obično nije prikladno za nehistonske proteine Nukleosomi se mogu preurediti tokom probave |
<ref>
;
nije naveden tekst za reference s imenom Rosenfeld P122, 1756–8935–6-S1-P122
<ref>
;
nije naveden tekst za reference s imenom Viens A 2004 68–76