Kozmid

Kozmid je tip hibridnog plazmida koji sadrži cos sekvencu lambda faga.[1] Često se koriste kao vektor kloniranja u genetičkom inženjerstvu. Kozmidi se mogu koristiti i za izgradnju genomske biblioteke. Prvi su ih opisali Collins i Hohn 1978.[2]

Kozmidi mogu sadržavati 37 do 52 (obično 45) kb DNK, a ograničenja zasnovana su na normalnoj veličini pakovanja bakteriofaga. Mogu replicirati kao plazmidi ako imaju odgovarajuće viljuške (ori): naprimer SV40 ori u ćelijama sisara, ColE1 ori za replikaciju dvolančane DNK ili f1 ori za replikaciju jednog lanca DNK u prokariot a. Često sadrže i gen za selekciju kao što je rezistencija na antibiotike, tako da transformirane ćelije mogu biti identificirane nanošenjem na podlogu koja sadrži antibiotik. One ćelije koje nemaju kozmid ne bi mogle da rastu.[3]

Za razliku od plazmida, oni se također mogu upakovati in vitro u fagnu kapsidu, korak koji zahtijeva „kohezivne krajeve“, poznate i kao „cos“ mjesta, koja se takođe koriste u kloniranju sa lambda fagima kao vektorima. Međutim, skoro svi lambda geni su deletirani, osim sekvence cos. Hibridna kozmidna DNK u kapsidama se zatim može transdukcijski prenijeti u bakterijske ćelije. Budući da postoji potreba za in vitro pakiranjem, uz najmanje 38 kb DNK između mjesta cos, vektor bez insertirane DNK neće biti spakiran (nestabilnost plazmida se povećava ako nova umetnuta DNK sadrži mnogo direktnih ponavljanja ili palindromnih (obrnutih) ponavljanja) DNK. Ovoj nestabilnosti se u velikoj mjeri može suprotstaviti upotrebom bakterije domaćina sa specifičnim mutacijama koje utiču na rekombinaciju DNK (Odsustvo obrnutih ponavljanja zabilježeno je u prvoj Hohn&Collins-ovoj publikaciji koja je citirana gore; vidi također[4]).

Cos sekvence

[uredi | uredi izvor]

Cos sekvence su duge ~200 baznih parova i neophodne su za pakiranje. Sadrže lokaciju cosN na kojoj terminaza, na svakom polulancu, odrezuje DNK. To uzrokuje linearizaciju kružnog kozmida s dva "kohezivna" ili "ljepljiva kraja" od po 12 bp. (DNK mora biti linearna da bi se uklopila u glavu faga.) Na mjestu cosB nalazi se terminaza dok cijepa DNK i razdvaja niti. Mesto cosQ sljedećeg kozmida drži terminaza nakon pakovanja prethodnog kozmida, kako bi se sprečila degradacija ćelijskimm DNKazama.

Svojstva i upotreba kozmida

[uredi | uredi izvor]
Shema kloniranja DNK u kozmidni vektor

Kozmidi su pretežno plazmidi sa bakterijskim oriV markerom za selekciju antibioticim i mjestom kloniranja, ali nose jedno ili odnedavno dva, cos mjesta izvedena iz bakteriofaga lambda. Ovisno o određenom cilju eksperimenta, dostupni su kozmidi širokog dometa domaćina, kozmidni iz šatla ili sisarski kozmidi (povezani sa SV40 oriV i markerima za elekciju sisara). Nosivost kosmida varira ovisno o veličini samog vektora, ali obično iznosi oko 40–45 kb. Postupak kloniranja uključuje generiranje dva vektorska kraka, koja su zatim pridružena stranoj DNK. Selekcija protiv kozmidne DNK divljeg tipa jednostavno se vrši izuzimanjem veličine. Kozmidi, dakle, uvijek formiraju kolonije, a ne plakove. Također je gustina klonova mnogo niža, sa oko 105–10 6 CFU po μg ligacijske DNK.

Nakon izgradnje rekombinantne lambda ili kozmidne biblioteke, ukupna DNK se prenosi u odgovarajućeg domaćina E. coli, tehnikom koja se naziva in vitro pakovanje. Neophodni ekstrakti pakiranja potiču od lizogene E. coli cI857 (red-gam-Sam i Dam (sklop glave), odnosno Eam sklop repa). Ovi ekstrakti prepoznat će i zapakirati rekombinantne molekule in vitro, generirajući ili zrele fagove čestice (vektori zasnovani na lambda fagu) ili rekombinantne plazmide sadržane u fagovim kapsidama (kosmidi). Te se razlike ogledaju u različitim učestalosti infekcija koje se vide u korist vektora koji zamjenjuju lambda. To nadoknađuje njihovu malo nižu nosivost. Biblioteke faga se takođe lakše pohranjuju i pregledavaju od kozmidnih biblioteka.

Ciljna DNK: genomska DNK koja se klonira mora se isjeći u odgovarajući raspon veličine restrikcijskih fragmenata. To se obično radi djelomičnim ograničenjem, nakon čega slijedi ili frakcioniranje veličine ili defosforilacija (upotrebom tele-crijevne fosfataze) kako bi se izbjeglo hromosomsko kodiranje, tj. ligacija fizički nepovezanih fragmenata.

Primjeri kozmidnih vektora

[uredi | uredi izvor]

Uobičajeni kozmidni vektori u upotrebi uključuju "SuperCos 1"

Reference

[uredi | uredi izvor]
  1. ^ Hohn B, Murray K (august 1977). "Packaging recombinant DNA molecules into bacteriophage particles in vitro". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8): 3259–63. Bibcode:1977PNAS...74.3259H. doi:10.1073/pnas.74.8.3259. PMC 431522. PMID 333431.
  2. ^ Collins J, Hohn B (septembar 1978). "Cosmids: a type of plasmid gene-cloning vector that is packageable in vitro in bacteriophage lambda heads". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9): 4242–6. Bibcode:1978PNAS...75.4242C. doi:10.1073/pnas.75.9.4242. PMC 336088. PMID 360212.
  3. ^ "Cosmids". Phillip McClean. Pristupljeno 4. 4. 2014.
  4. ^ Collins J (1981). "Instability of palindromic DNA in Escherichia coli". Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45 Pt 1: 409–16. doi:10.1101/SQB.1981.045.01.055. PMID 6271486.

Dopunska literatura

[uredi | uredi izvor]

Vanjski linkovi

[uredi | uredi izvor]

Šablon:Ssmoreplicirajuće organske strukture Šablon:Organizmi