Southern blot

Elektroforeza na agaroznom gelu: agarozni gel
Pladanj sa hrpom koja se sastoji od utega, papirnatih peškira, membrana od nitroceluloze ili najlona, gela, rastvora soli i staklene ploče.
Southern blot membrana nakon hibridizacije i ispiranja
Southern blotni agarozni gel pod ultravioletnom iluminacijom
Southern blot-ov autoradiogram.

Southern blot je metod koja se koristi u molekulskoj biologiji za otkrivanje određene sekvence DNK u njenim uzoercima. Southern blot kombinira prijenos elektroforezom odvojenih fragmenata DNK na membranu filtra i naknadno otkrivanje fragmenata pomoću hibridizacijske sonde.[1]

Metod je imenovan po britanskom biologu Edwinu Southernu, koji ju je prvi objavio u 1975.[2] Ostali metodi blotiranja (tj. western blot,[3] northern blot, eastern blot, southwestern blot) koji koriste slične principe, ali za RNK ili proteine, kasnije su imenovani u odnosu na ime Edwina Southerna. Kako je oznaka eponimna, Southern se označava velim početnim slovom, kao što je uobičajeno za vlastite imenice. Nazivi za druge metode blotiranja mogu slijediti ovu konvenciju, po analogiji.[4]

Metod

[uredi | uredi izvor]
  1. Za rezanje DNK u fragmente manje molekulske težine koristi se endonukleaza.
  2. DNK fragmenti se zatim elektroforeziraju na agaroznom gelu, kako bi se razdvojili po veličini.
  3. Ako su neki od fragmenata DNK veći od 15 kb, tada se gel prije blotiranja može tretirati kiselinom, poput razrijeđene HCl-a. Ovo stvara fragmente DNK, razbijajući DNK na manje komade, omogućavajući tako efikasniji prenos iz gela u membranu.
  4. Ako se koriste metode prijenosa pomoću alkalnih supstanci, DNK gel se stavlja u alkalni rastvor (koji obično sadrži natrij-hidroksid) da bi se denaturirala dvolančana DNK. Denaturacija u alkalnom okruženju može poboljšati vezivanje negativno nabijenih timinskih ostataka DNK na pozitivno nabijene amino-grupe vještačke membrane, razdvajajući ih u pojedinačne DNK lance za kasnije hibridiziraju na sondu (vidi dolje) i uništava bilo koja preostala RNK koja je još uvijek prisutna uz DNK. Izbor alkalnih umjesto neutralnih metoda prijenosa, međutim, često je empirijski i može rezultirati ekvivalentnim rezultatima.
  5. List nitroceluloze (ili, alternativno, najlona) membrane postavlja se na vrh (ili ispod, ovisno o smjeru prijenosa) gela. Pritisak se ravnomjerno primjenjuje na gel (bilo usisavanjem, bilo postavljanjem snopa papirnatih maramica i tegova na vrh membrane i gela), kako bi se osigurao dobar i ravnomjeran kontakt između gela i membrane. Ako se prenos vrši usisavanjem, koristi se 20X SSC pufer kako bi se osiguralo zatvaranje i sprečilo sušenje gela. Prenos pufera kapilarnim djelovanjem iz područja sa visokim vodenim potencijalom u područje sa malim vodenim potencijalom (obično filter papir i papirnati uložak) koristi se za premještanje DNK iz gela na membranu; ionska izmjena interakcije veže DNK za membranu, zbog negativnog naboja DNK i pozitivnog naboja membrane.
  6. Membrana se zatim peče u vakuumu ili uobičajenoj pećnici na 80 °C tokom dva sata (standardni uslovi; nitrocelulozna ili najlonska membrana) ili izlaže ultraljubičastom zračenju (najlonska membrana) da trajno pričvrsti prenesenu DNK na membranu.
  7. Membrana se zatim izlaže hibridizacijskoj sondi – jednom DNK fragmentu sa određenom sekvencom čije prisustvo u ciljnoj DNK treba utvrditi. DNK sonda je označena tako da se može detektirati, obično ugrađivanjem radioaktivnog markera ili označavanjem molekula fluorescentncijom ili hromogenom bojom. U nekim slučajevima, sonda za hibridizaciju može se napraviti od RNK, a ne od DNK. Da bi se osigurala specifičnost vezivanja sonde za DNK uzorka, najčešći metodi hibridizacije koriste DNK sperme lososa ili haringe, za blokiranje površine membrane i ciljane DNK, deionizirani formamid i deterdžent, kao što je SDS, za smanjenje nespecifičnog vezivanja sonde.
  8. Nakon hibridizacije, višak sonde se ispere s membrane (obično pomoću SSC-pufera), a obrazac hibridizacije na rendgenskom filmu se vizualizuje pomoću autoradiogrfije u slučaju radioaktivne ili fluorescentne sonde ili razvojem boje na membrani ako se koristi hromogen metod detekcije.

Rezultat

[uredi | uredi izvor]

Hibridizacijske sonde sa određenim fragmentom DNK na membrani filtra ukazuje da taj fragment sadrži sekvencu DNK koja je komplementarna sondi.

Korak prenosa DNK iz gela za elektroforezu u membranu omogućava lahko vezanje označene sonde za hibridizaciju na veličine frakcioniranw DNK. Omogućava i fiksiranje hibrida ciljne sonde, potrebne za analizu pomoću autoradiografije ili drugih metoda otkrivanja. Southern blotovi izvode se restrikcijskom enzimom, a digestirani genomski fragnenti DNK mogu se koristiti za određivanje broja sekvenci (npr. kopija gena) u genomu. Sonda koja se hibridizira samo s jednim DNK segmentom koji nije presječen restrikcijskim enzimom proizvest će jednu traku na Southern blot-u, dok će se vjerovatno primijetiti više traka kada se sonda hibridizira u nekoliko vrlo sličnih sekvenci (npr. onih koji mogu biti rezultat dupliranja sekvence). Modifikacija uslova hibridizacije (naprimjer, povećanje temperature hibridizacije ili smanjenje koncentracije soli) može se koristiti za povećanje specifičnosti i smanjenje hibridizacijske sonde na sekvence manje od 100% slične.

Aplikacije

[uredi | uredi izvor]

Southern blotinški prijenos može se koristiti za kloniranje zasnovano na homologiji na osnovu aminokiselinske sekvence proteinskog proizvoda ciljnog gena. Oligonukleotidi su dizajnirani tako da su slični ciljnoj sekvenci. Oligonukleotidi se hemijski sintetiziraju, radioaktivno obilježavaju i koriste za pregled DNK biblioteke ili drugih kolekcija kloniranih fragmenata DNK. Sekvence koje se hibridiziraju sa sondom za hibridizaciju dalje se analiziraju, naprimjer, da bi se dobila sekvenca pune dužine ciljanog gena.

Southern blot se takođe može koristiti za identifikaciju metiliranih mjesta na određenim genima. Posebno su korisne restrikcijske nukleaze MspI i HpaII, koje obje prepoznaju i cijepaju u istoj sekvenci. Međutim, HpaII zahtijeva da se C unutar tog mjesta metilira, dok MspI cijepi samo DNK koja je na tom mjestu nemetilirana. Zato će bilo koja metilirana mjesta unutar analizirane sekvence određenom sondom cijepati prvi, ali ne i drugi, enzim.[5]

Također pogledajte

[uredi | uredi izvor]

Reference

[uredi | uredi izvor]
  1. ^ https://www.genome.gov/genetics-glossary/Southern-Blot
  2. ^ Southern, Edwin Mellor (5. 11. 1975). "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis". Journal of Molecular Biology. 98 (3): 503–517. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0. ISSN 0022-2836. PMID 1195397. Navedeno je više parametara |author= i |last= (pomoć)
  3. ^ Towbin; Staehelin, T; Gordon, J; et al. (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications". PNAS. 76 (9): 4350–4. doi:10.1073/pnas.76.9.4350. PMC 411572. PMID 388439.
  4. ^ Burnette, W. Neal (april 1981). "Western Blotting: Electrophoretic Transfer of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels to Unmodified Nitrocellulose and Radiographic Detection with Antibody and Radioiodinated Protein A". Analytical Biochemistry. 112 (2): 195–203. doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5. ISSN 0003-2697. PMID 6266278.
  5. ^ Biochemistry 3rd Edition, Matthews, Van Holde et al, Addison Wesley Publishing, pg 977

Vanjski linkovi

[uredi | uredi izvor]