CRISPR

CRISPR Cascade protein (cyan) bound to CRISPR RNA (green) and phage DNA (red)[1]
Identifiers
Oργανισμός Escherichia coli
Συμβολισμός CRISPR
Entrez 947229
PDB 4QYZ
RefSeq (Prot) NP_417241.1
UniProt P38036

H CRISPR (/ˈkrɪspər/) (ακρωνύμιο των clustered regularly interspaced short palindromic repeats) είναι μια οικογένεια αλληλουχιών DNA που βρίσκονται στα γονιδιώματα προκαρυωτικών οργανισμών, όπως τα βακτήρια και τα αρχαία[2].Οι αλληλουχίες αυτές προέρχονται από τμήματα DNA βακτηριοφάγων που είχαν προηγουμένως μολύνει τον προκαρυώτη. Χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση και την καταστροφή του DNA από παρόμοιους βακτηριοφάγους κατά τη διάρκεια μεταγενέστερων μολύνσεων. Ως εκ τούτου, οι αλληλουχίες αυτές διαδραματίζουν βασικό ρόλο στο σύστημα αντιικής (δηλαδή αντι-φάγου) άμυνας των προκαρυωτών και παρέχουν μια μορφή επίκτητης ανοσίας.[3][4][5][6] Το CRISPR βρίσκεται περίπου στο 50% των βακτηριακών γονιδιωμάτων που έχουν αλληλουχηθεί και σχεδόν στο 90% των αρχαίων που έχουν αλληλουχηθεί.

Η Cas9 (ή «CRISPR-associated protein 9») είναι ένα ένζυμο που χρησιμοποιεί τις αλληλουχίες CRISPR ως οδηγό για να αναγνωρίζει και να ανοίγει συγκεκριμένες αλυσίδες DNA που είναι συμπληρωματικές προς την αλληλουχία CRISPR. Τα ένζυμα Cas9 μαζί με τις αλληλουχίες CRISPR αποτελούν τη βάση μιας τεχνολογίας γνωστής ως CRISPR-Cas9 που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επεξεργασία γονιδίων μέσα στους οργανισμούς[7][8] Αυτή η διαδικασία επεξεργασίας έχει μια ευρεία ποικιλία εφαρμογών, συμπεριλαμβανομένης της βασικής βιολογικής έρευνας, της ανάπτυξης βιοτεχνολογικών προϊόντων και της θεραπείας ασθενειών[9][10] Η ανάπτυξη της τεχνικής επεξεργασίας γονιδιώματος CRISPR-Cas9 αναγνωρίστηκε με το βραβείο Νόμπελ Χημείας το 2020, το οποίο απονεμήθηκε στις Emmanuelle Charpentier και Jennifer Doudna [11][12]

Ιστορία

Επαναλαμβανόμενες ακολουθίες

Η ανακάλυψη των ομαδοποιημένων επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών DNA πραγματοποιήθηκε ανεξάρτητα σε τρία μέρη του κόσμου. Η πρώτη περιγραφή αυτού που αργότερα θα ονομαζόταν CRISPR προέρχεται από τον ερευνητή του Πανεπιστημίου της Οσάκα Yoshizumi Ishino και τους συναδέλφους του το 1987. Κλωνοποίησαν τυχαία μέρος μιας αλληλουχίας CRISPR μαζί με το γονίδιο «iap» (ισοζυμική μετατροπή της αλκαλικής φωσφατάσης) από το γονιδίωμα της Escherichia coli [13][13] που ήταν ο στόχος τους. Η οργάνωση των επαναλήψεων ήταν ασυνήθιστη. Οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες τυπικά διατάσσονται διαδοχικά, χωρίς να παρεμβάλλονται διαφορετικές αλληλουχίες [10][14]. Δεν γνώριζαν τη λειτουργία των διακοπτόμενων ομαδοποιημένων επαναλήψεων.

Το 1993, ερευνητές του Mycobacterium tuberculosis στις Κάτω Χώρες δημοσίευσαν δύο άρθρα σχετικά με μια συστάδα διακοπτόμενων άμεσων επαναλήψεων (DR) στο εν λόγω βακτήριο. Αναγνώρισαν την ποικιλομορφία των αλληλουχιών που παρεμβάλλονταν στις άμεσες επαναλήψεις μεταξύ των διαφόρων στελεχών του M. tuberculosis[15] και χρησιμοποίησαν αυτή την ιδιότητα για να σχεδιάσουν μια μέθοδο τυποποίησης που ονομάστηκε spoligotyping, η οποία χρησιμοποιείται ακόμη και σήμερα [16][17].

Ο Francisco Mojica του Πανεπιστημίου του Αλικάντε στην Ισπανία μελέτησε τις επαναλήψεις που παρατηρούνται στους οργανισμούς των ειδών Haloferax και Haloarcula και τη λειτουργία τους. Ο επόπτης του Mojica υπέθεσε τότε ότι οι ομαδοποιημένες επαναλήψεις είχαν ρόλο στον σωστό διαχωρισμό του αντιγραμμένου DNA στα θυγατρικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης, επειδή πλασμίδια και χρωμοσώματα με πανομοιότυπες διατάξεις επαναλήψεων δεν μπορούσαν να συνυπάρξουν στον Haloferax volcanii. Για πρώτη φορά παρατηρήθηκε επίσης η μεταγραφή των διακοπτόμενων επαναλήψεων- αυτός ήταν ο πρώτος πλήρης χαρακτηρισμός του CRISPR.[17][18] Μέχρι το 2000, ο Mojica πραγματοποίησε μια έρευνα στην επιστημονική βιβλιογραφία και ένας από τους φοιτητές του πραγματοποίησε μια αναζήτηση σε δημοσιευμένα γονιδιώματα με ένα πρόγραμμα που επινόησε ο ίδιος. Εντόπισαν διακεκομμένες επαναλήψεις σε 20 είδη μικροβίων που ανήκαν στην ίδια οικογένεια[19]. Επειδή οι αλληλουχίες αυτές ήταν διακεκομμένες, ο Mojica ονόμασε αρχικά τις αλληλουχίες αυτές «σύντομες επαναλήψεις με τακτά διαστήματα» (short regular spaced repeats, SRSR)[20]. Το 2001, ο Mojica και ο Ruud Jansen, οι οποίοι αναζητούσαν μια επιπλέον διακοπτόμενη επανάληψη, πρότειναν το ακρωνύμιο CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) για να αμβλύνουν τη σύγχυση που προέκυπτε από τα πολυάριθμα ακρωνύμια που χρησιμοποιούνταν για την περιγραφή των αλληλουχιών στην επιστημονική βιβλιογραφία[18][21]. Το 2002, οι Tang, et al. έδειξαν στοιχεία ότι οι επαναλαμβανόμενες περιοχές CRISPR από το γονιδίωμα του Archaeoglobus fulgidus μεταγράφηκαν στα μακρά μόρια RNA που στη συνέχεια επεξεργάστηκαν σε μικρά RNAs μήκους μονάδας, καθώς και σε ορισμένες μεγαλύτερες μορφές 2, 3 ή περισσότερων μονάδων επανάληψης διαστήματος[22][23].

Το 2005, ο ερευνητής του γιαουρτιού Rodolphe Barrangou ανακάλυψε ότι ο Streptococcus thermophilus, μετά από επαναλαμβανόμενες προκλήσεις φάγων, αναπτύσσει αυξημένη αντοχή στους φάγους και αυτή η αυξημένη αντοχή οφείλεται στην ενσωμάτωση πρόσθετων αλληλουχιών διαστήματος CRISPR[24] Η δανέζικη εταιρεία τροφίμων Danisco, για την οποία εργαζόταν τότε ο Barrangou, ανέπτυξε στη συνέχεια στελέχη S. thermophilus ανθεκτικά στους φάγους για χρήση στην παραγωγή γιαουρτιού. Η Danisco εξαγοράστηκε αργότερα από την DuPont, η οποία «κατέχει περίπου το 50% της παγκόσμιας αγοράς γαλακτοκομικών καλλιεργειών» και η τεχνολογία καθιερώθηκε [24].

Συστήματα που σχετίζονται με το CRISPR

Μια σημαντική προσθήκη στην κατανόηση του CRISPR ήρθε με την παρατήρηση του Jansen ότι το σύμπλεγμα επαναλήψεων των προκαρυωτών συνοδεύεται από ένα σύνολο ομόλογων γονιδίων που αποτελούν τα συστήματα που σχετίζονται με το CRISPR ή τα γονίδια cas. Αρχικά αναγνωρίστηκαν τέσσερα γονίδια cas (cas 1-4). Οι πρωτεΐνες Cas εμφάνιζαν μοτίβα ελικάσης και νουκλεάσης, υποδηλώνοντας έναν ρόλο στη δυναμική δομή των τόπων CRISPR[25].Σε αυτή τη δημοσίευση, το ακρωνύμιο CRISPR χρησιμοποιήθηκε ως η καθολική ονομασία αυτού του μοτίβου. Ωστόσο, η λειτουργία του CRISPR παρέμενε αινιγματική.

Το 2005, τρεις ανεξάρτητες ερευνητικές ομάδες έδειξαν ότι ορισμένοι αποστάτες CRISPR προέρχονται από DNA φάγων και εξωχρωμοσωμικό DNA, όπως πλασμίδια[26][27][28].Στην πραγματικότητα, οι αποστάτες είναι θραύσματα DNA που συγκεντρώθηκαν από ιούς που προσπάθησαν προηγουμένως να επιτεθούν στο κύτταρο. Η προέλευση των spacers ήταν ένα σημάδι ότι το σύστημα CRISPR-cas θα μπορούσε να έχει ρόλο στην προσαρμοστική ανοσία στα βακτήρια[29][30].Και οι τρεις μελέτες που πρότειναν αυτή την ιδέα απορρίφθηκαν αρχικά από περιοδικά υψηλού κύρους, αλλά τελικά εμφανίστηκαν σε άλλα περιοδικά [31].

Η πρώτη δημοσίευση[27] που πρότεινε τον ρόλο του CRISPR-Cas στη μικροβιακή ανοσία, από τον Mojica και τους συνεργάτες του στο Πανεπιστήμιο του Αλικάντε, προέβλεψε έναν ρόλο της μεταγραφής των διαστημάτων RNA στην αναγνώριση των στόχων σε έναν μηχανισμό που θα μπορούσε να είναι ανάλογος με το σύστημα παρεμβολής RNA που χρησιμοποιείται από τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Ο Koonin και οι συνεργάτες του επέκτειναν αυτή την υπόθεση της παρεμβολής RNA προτείνοντας μηχανισμούς δράσης για τους διάφορους υποτύπους CRISPR-Cas σύμφωνα με την προβλεπόμενη λειτουργία των πρωτεϊνών τους[32].

Οι πειραματικές εργασίες διαφόρων ομάδων αποκάλυψαν τους βασικούς μηχανισμούς της ανοσίας CRISPR-Cas. Το 2007 δημοσιεύθηκαν οι πρώτες πειραματικές αποδείξεις ότι το CRISPR ήταν ένα προσαρμοστικό ανοσοποιητικό σύστημα[5][10]. Μια περιοχή CRISPR στον Streptococcus thermophilus απέκτησε διαστήματα από το DNA ενός βακτηριοφάγου που τον μόλυνε. Οι ερευνητές χειραγώγησαν την ανθεκτικότητα του S. thermophilus σε διαφορετικούς τύπους φάγων προσθέτοντας και διαγράφοντας spacers των οποίων η αλληλουχία ταίριαζε με εκείνες που βρέθηκαν στους εξεταζόμενους φάγους [33][34] Το 2008, οι Brouns και Van der Oost εντόπισαν ένα σύμπλεγμα πρωτεϊνών Cas (που ονομάζεται Cascade) που στο E. coli έκοψε τον πρόδρομο CRISPR RNA εντός των επαναλήψεων σε ώριμα μόρια RNA που περιείχαν αποστάτες και ονομάζονταν CRISPR RNA (crRNA), τα οποία παρέμεναν συνδεδεμένα με το πρωτεϊνικό σύμπλοκο[35]. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η Cascade, το crRNA και μια ελικάση/νουκλεάση (Cas3) απαιτούνταν για να παρέχουν σε έναν βακτηριακό ξενιστή ανοσία έναντι μόλυνσης από έναν ιό DNA. Σχεδιάζοντας ένα CRISPR κατά του ιού, απέδειξαν ότι δύο προσανατολισμοί του crRNA (sense/antisense) παρείχαν ανοσία, υποδεικνύοντας ότι οι οδηγοί crRNA στόχευαν dsDNA. Εκείνη τη χρονιά οι Marraffini και Sontheimer επιβεβαίωσαν ότι μια αλληλουχία CRISPR του S. epidermidis στόχευε το DNA και όχι το RNA για να αποτρέψει τη σύζευξη. Αυτό το εύρημα ήταν σε αντίθεση με τον προτεινόμενο μηχανισμό RNA-παρεμβολής της ανοσίας CRISPR-Cas, αν και ένα σύστημα CRISPR-Cas που στοχεύει ξένο RNA βρέθηκε αργότερα στον Pyrococcus furiosus[10][34] Μια μελέτη του 2010 έδειξε ότι το CRISPR-Cas κόβει και τα δύο σκέλη του DNA του φάγου και του πλασμιδιακού DNA στον S. thermophilus [36].

Cas9

Κύριο άρθρο: Cas9

Ένα απλούστερο σύστημα CRISPR από τον Streptococcus pyogenes βασίζεται στην πρωτεΐνη Cas9. Η ενδονουκλεάση Cas9 είναι ένα σύστημα τεσσάρων συστατικών που περιλαμβάνει δύο μικρά μόρια: το crRNA και το trans-ενεργοποιητικό CRISPR RNA (tracrRNA)[37][38]. Το 2012, η Jennifer Doudna και η Emmanuelle Charpentier επανασχεδίασαν την ενδονουκλεάση Cas9 σε ένα πιο εύχρηστο σύστημα δύο συστατικών, συγχωνεύοντας τα δύο μόρια RNA σε ένα «single-guide RNA» που, όταν συνδυάζεται με το Cas9, μπορεί να βρει και να κόψει τον στόχο DNA που καθορίζεται από το guide RNA. Η συμβολή αυτή ήταν τόσο σημαντική που αναγνωρίστηκε με το βραβείο Νόμπελ Χημείας το 2020. Με τον χειρισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του καθοδηγητικού RNA, το τεχνητό σύστημα Cas9 μπορούσε να προγραμματιστεί ώστε να στοχεύει οποιαδήποτε αλληλουχία DNA για διαχωρισμό[39]. Μια άλλη ομάδα συνεργατών, αποτελούμενη από τον Virginijus Šikšnysμαζί με τους Gasiūnas, Barrangou και Horvath, έδειξε ότι το Cas9 από το σύστημα CRISPR του S. thermophilus μπορεί επίσης να επαναπρογραμματιστεί ώστε να στοχεύει μια περιοχή της επιλογής τους, αλλάζοντας την αλληλουχία του crRNA του. Αυτές οι εξελίξεις τροφοδότησαν τις προσπάθειες για την επεξεργασία γονιδιωμάτων με το τροποποιημένο σύστημα CRISPR-Cas9[17].

Ομάδες με επικεφαλής τους Feng Zhang και George Church δημοσίευσαν ταυτόχρονα περιγραφές της επεξεργασίας γονιδιώματος σε καλλιέργειες ανθρώπινων κυττάρων με τη χρήση του CRISPR-Cas9 για πρώτη φορά [10][40][41].Έκτοτε έχει χρησιμοποιηθεί σε ένα ευρύ φάσμα οργανισμών, συμπεριλαμβανομένης της ζύμης αρτοποιίας (Saccharomyces cerevisiae)[42][43][44], του ευκαιριακού παθογόνου Candida albicans[45][46], του ψαριού ζέβρα (Danio rerio)[47], της μύγας των φρούτων (Drosophila melanogaster)[48][49], μυρμήγκια (Harpegnathos saltator[50] και Ooceraea biroi [51]), κουνούπια (Aedes aegypti[52]), νηματώδεις (Caenorhabditis elegans)[53],φυτά[54], ποντίκια (Mus musculus domesticus)[55][56], πίθηκοι [57] και ανθρώπινα έμβρυα [58].

Το CRISPR έχει τροποποιηθεί ώστε να κατασκευάζει προγραμματιζόμενους μεταγραφικούς παράγοντες που επιτρέπουν τη στόχευση και την ενεργοποίηση ή την αποσιώπηση συγκεκριμένων γονιδίων[59].

Το σύστημα CRISPR-Cas9 έχει δείξει ότι μπορεί να κάνει αποτελεσματικές γονιδιακές επεμβάσεις σε ανθρώπινα τριπύρηνα ζυγωτά που περιγράφηκαν για πρώτη φορά το 2015 σε μια εργασία των Κινέζων επιστημόνων P. Liang και Y. Xu. Το σύστημα πραγματοποίησε επιτυχή διάσπαση της μεταλλαγμένης β-αιμοσφαιρίνης (HBB) σε 28 από τα 54 έμβρυα. Τέσσερα από τα 28 έμβρυα ανασυνδυάστηκαν επιτυχώς χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο δότη που έδωσαν οι επιστήμονες. Οι επιστήμονες έδειξαν ότι κατά τον ανασυνδυασμό του DNA της διασπασμένης αλυσίδας, η ομόλογη ενδογενής αλληλουχία HBD ανταγωνίζεται το εξωγενές πρότυπο δότη. Η επιδιόρθωση του DNA στα ανθρώπινα έμβρυα είναι πολύ πιο περίπλοκη και ιδιαίτερη από ό,τι στα παράγωγα βλαστικά κύτταρα[60].

Cas12a

Κύριο άρθρο: Cas12a

Το 2015, η νουκλεάση Cas12a (παλαιότερα γνωστή ως Cpf1[61]) χαρακτηρίστηκε στο σύστημα CRISPR-Cpf1 του βακτηρίου Francisella novicida[62][63].Το αρχικό της όνομα, από έναν ορισμό της οικογένειας πρωτεϊνών TIGRFAMs που κατασκευάστηκε το 2012, αντανακλά την επικράτηση του υποτύπου CRISPR-Cas της στις γενεαλογίες Prevotella και Francisella. Το Cas12a παρουσίασε αρκετές βασικές διαφορές από το Cas9, μεταξύ των οποίων: προκαλεί μια «κλιμακωτή» τομή σε δίκλωνο DNA σε αντίθεση με την «αμβλεία» τομή που παράγει το Cas9, βασίζεται σε ένα «πλούσιο σε Τ» PAM (παρέχοντας εναλλακτικές θέσεις στόχευσης σε σχέση με το Cas9) και απαιτεί μόνο ένα CRISPR RNA (crRNA) για την επιτυχή στόχευση. Αντίθετα, το Cas9 απαιτεί τόσο crRNA όσο και ένα trans-ενεργοποιητικό crRNA (tracrRNA).

Αυτές οι διαφορές ενδέχεται να προσδίδουν στο Cas12a ορισμένα πλεονεκτήματα έναντι του Cas9. Για παράδειγμα, τα μικρά crRNA του Cas12a είναι ιδανικά για πολυπλεξική επεξεργασία γονιδιώματος, καθώς περισσότερα από αυτά μπορούν να συσκευαστούν σε έναν φορέα από ό,τι τα sgRNA του Cas9. Οι κολλώδεις προεξοχές 5′ που αφήνει το Cas12a μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για τη συναρμολόγηση DNA που είναι πολύ πιο συγκεκριμένη για τον στόχο από την παραδοσιακή κλωνοποίηση με ένζυμο περιορισμού[64].Τέλος, το Cas12a κόβει το DNA 18-23 ζεύγη βάσεων κατάντη της θέσης PAM. Αυτό σημαίνει ότι δεν υπάρχει διακοπή της αλληλουχίας αναγνώρισης μετά την επιδιόρθωση και έτσι το Cas12a επιτρέπει πολλαπλούς γύρους διάσπασης του DNA. Αντίθετα, δεδομένου ότι η Cas9 κόβει μόνο 3 ζεύγη βάσεων ανάντη της θέσης PAM, το μονοπάτι NHEJ οδηγεί σε μεταλλάξεις indel που καταστρέφουν την αλληλουχία αναγνώρισης, εμποδίζοντας έτσι περαιτέρω γύρους κοπής. Θεωρητικά, οι επαναλαμβανόμενοι γύροι διάσπασης του DNA θα πρέπει να προκαλούν αυξημένη ευκαιρία για την πραγματοποίηση της επιθυμητής γονιδιωματικής επεξεργασίας[65]. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της Cas12a, σε σύγκριση με την Cas9, είναι ότι μετά την κοπή του στόχου της, η Cas12a παραμένει συνδεδεμένη με τον στόχο και στη συνέχεια κόβει άλλα μόρια ssDNA χωρίς διάκριση[66]. Αυτή η ιδιότητα ονομάζεται «παράπλευρη δραστηριότητα διάσπασης» ή «trans-cleavage» και έχει αξιοποιηθεί για την ανάπτυξη διαφόρων διαγνωστικών τεχνολογιών[67][68].

Cas13

Το 2016 χαρακτηρίστηκε η νουκλεάση Cas13a (πρώην γνωστή ως C2c2) από το βακτήριο Leptotrichia shahii. Η Cas13 είναι μια RNA-καθοδηγούμενη RNA-ενδονουκλεάση, πράγμα που σημαίνει ότι δεν κόβει DNA, αλλά μόνο μονόκλωνο RNA. Η Cas13 καθοδηγείται από το crRNA της σε έναν ssRNA-στόχο και δεσμεύει και κόβει τον στόχο. Παρόμοια με την Cas12a, η Cas13 παραμένει συνδεδεμένη στο στόχο και στη συνέχεια κόβει άλλα μόρια ssRNA χωρίς διάκριση [69]. Αυτή η παράπλευρη ιδιότητα διάσπασης έχει αξιοποιηθεί για την ανάπτυξη διαφόρων διαγνωστικών τεχνολογιών [70][71][72].

Το 2021, ο Δρ Hui Yang χαρακτήρισε νέες παραλλαγές της πρωτεΐνης Cas13 σε μικρογραφία (mCas13), τις Cas13X και Cas13Y. Χρησιμοποιώντας ένα μικρό τμήμα της αλληλουχίας του γονιδίου N από τον SARS-CoV-2 ως στόχο για τον χαρακτηρισμό της mCas13, αποκάλυψε την ευαισθησία και την ειδικότητα της mCas13 σε συνδυασμό με την RT-LAMP για την ανίχνευση του SARS-CoV-2 τόσο σε συνθετικά όσο και σε κλινικά δείγματα σε σχέση με άλλες διαθέσιμες τυπικές δοκιμασίες όπως η RT-qPCR (1 αντίγραφο/μL)[73].

Δομή

Επαναλήψεις και διαστήματα

Η συστοιχία CRISPR αποτελείται από μια πλούσια σε ΑΤ αρχική αλληλουχία, ακολουθούμενη από σύντομες επαναλήψεις που χωρίζονται από μοναδικά διαστήματα[74].Οι επαναλήψεις CRISPR κυμαίνονται συνήθως σε μέγεθος από 28 έως 37 ζεύγη βάσεων (bps), αν και μπορεί να είναι τόσο λίγες όσο 23 bps και τόσο πολλές όσο 55 bps [75].Ορισμένες παρουσιάζουν συμμετρία δυάδας, υποδηλώνοντας το σχηματισμό μιας δευτερογενούς δομής όπως ένας βρόχος-στέλεχος («φουρκέτα») στο RNA, ενώ άλλες είναι σχεδιασμένες να είναι αδόμητες. Το μέγεθος των διατημάτων στις διάφορες συστοιχίες CRISPR είναι συνήθως 32 έως 38 bp (εύρος 21 έως 72 bp)[75]. Νέα διαστήματα μπορούν να εμφανιστούν γρήγορα ως μέρος της ανοσολογικής απόκρισης στη μόλυνση από φάγο [76] Υπάρχουν συνήθως λιγότερες από 50 μονάδες της αλληλουχίας επανάληψης-διαστήματα σε μια συστοιχία CRISPR[75].

Γονίδια Cas και υπότυποι CRISPR

Μικρές συστάδες γονιδίων cas βρίσκονται συχνά δίπλα σε συστοιχίες επαναλαμβανόμενων διαστημάτων CRISPR. Συλλογικά, τα 93 γονίδια cas ομαδοποιούνται σε 35 οικογένειες με βάση την ομοιότητα αλληλουχίας των πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται. 11 από τις 35 οικογένειες αποτελούν τον πυρήνα cas, ο οποίος περιλαμβάνει τις οικογένειες πρωτεϊνών Cas1 έως Cas9. Ένας πλήρης τόπος CRISPR-Cas έχει τουλάχιστον ένα γονίδιο που ανήκει στον πυρήνα cas[77].

Τα συστήματα CRISPR-Cas διακρίνονται σε δύο κατηγορίες. Τα συστήματα της κατηγορίας 1 χρησιμοποιούν ένα σύμπλεγμα πολλαπλών πρωτεϊνών Cas για την αποικοδόμηση ξένων νουκλεϊκών οξέων. Τα συστήματα της κατηγορίας 2 χρησιμοποιούν μία μόνο μεγάλη πρωτεΐνη Cas για τον ίδιο σκοπό. Η κλάση 1 χωρίζεται σε τύπους I, III και IV- η κλάση 2 χωρίζεται σε τύπους II, V και VI [78].Οι 6 τύποι συστημάτων χωρίζονται σε 19 υπότυπους[79].Κάθε τύπος και οι περισσότεροι υπότυποι χαρακτηρίζονται από ένα «γονίδιο υπογραφής» που απαντάται σχεδόν αποκλειστικά στην κατηγορία. Η ταξινόμηση βασίζεται επίσης στο συμπλήρωμα των γονιδίων cas που είναι παρόντα. Τα περισσότερα συστήματα CRISPR-Cas διαθέτουν μια πρωτεΐνη Cas1. Η φυλογένεση των πρωτεϊνών Cas1 γενικά συμφωνεί με το σύστημα ταξινόμησης[80], αλλά υπάρχουν εξαιρέσεις λόγω της αναδιάταξης των μονάδων[77]. Πολλοί οργανισμοί περιέχουν πολλαπλά συστήματα CRISPR-Cas, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι συμβατά και μπορεί να μοιράζονται συστατικά[81][82]. Η σποραδική κατανομή των υποτύπων CRISPR-Cas υποδηλώνει ότι το σύστημα CRISPR-Cas υπόκειται σε οριζόντια γονιδιακή μεταφορά κατά τη διάρκεια της μικροβιακής εξέλιξης.

Μηχανισμός

Η ανοσία CRISPR-Cas είναι μια φυσική διαδικασία των βακτηρίων και των αρχαίων[83]. Η CRISPR-Cas αποτρέπει τη μόλυνση από βακτηριοφάγους, τη σύζευξη και το φυσικό μετασχηματισμό, αποικοδομώντας τα ξένα νουκλεϊκά οξέα που εισέρχονται στο κύτταρο[34].

Απόκτηση διαστήματος

Όταν ένας μικροοργανισμός προσβάλλεται από έναν βακτηριοφάγο, το πρώτο στάδιο της ανοσολογικής απόκρισης είναι η σύλληψη του DNA του φάγου και η εισαγωγή του σε έναν τόπο CRISPR με τη μορφή διαστήματος. Οι Cas1 και Cas2 βρίσκονται και στους δύο τύπους ανοσοποιητικών συστημάτων CRISPR-Cas, γεγονός που υποδηλώνει ότι εμπλέκονται στην απόκτηση διαστήματος. Μελέτες μετάλλαξης επιβεβαίωσαν αυτή την υπόθεση, δείχνοντας ότι η αφαίρεση των Cas1 ή Cas2 σταμάτησε την απόκτηση διαστήματος, χωρίς να επηρεάσει την ανοσολογική απόκριση CRISPR[84][85][86][87][88].

Πολλαπλές πρωτεΐνες Cas1 έχουν χαρακτηριστεί και οι δομές τους έχουν επιλυθεί[89][90][91] Οι πρωτεΐνες Cas1 έχουν ποικίλες αλληλουχίες αμινοξέων. Ωστόσο, οι κρυσταλλικές δομές τους είναι παρόμοιες και όλες οι καθαρισμένες πρωτεΐνες Cas1 είναι μεταλλοεξαρτώμενες νουκλεάσες/ενσωματώματα που προσδένονται στο DNA με τρόπο ανεξάρτητο από την αλληλουχία[81].Αντιπροσωπευτικές πρωτεΐνες Cas2 έχουν χαρακτηριστεί και διαθέτουν είτε (μονόκλωνη) ssRNA-[92] είτε (δίκλωνη) dsDNA-[93][94] ειδική δραστικότητα ενδοριβονουκλεάσης.

Στο σύστημα I-E του E. coli το Cas1 και το Cas2 σχηματίζουν ένα σύμπλοκο όπου ένα διμερές Cas2 γεφυρώνει δύο διμερή Cas1[95].Σε αυτό το σύμπλοκο το Cas2 επιτελεί έναν μη ενζυμικό ρόλο ικριώματος[95] δεσμεύοντας δίκλωνα θραύσματα του εισβάλλοντος DNA, ενώ το Cas1 δεσμεύει τα μονόκλωνα πλευρικά τμήματα του DNA και καταλύει την ενσωμάτωσή τους στις συστοιχίες CRISPR[96][97][98].Οι νέοι αποστάτες προστίθενται συνήθως στην αρχή του CRISPR δίπλα στην αρχηγική αλληλουχία δημιουργώντας ένα χρονολογικό αρχείο των ιικών μολύνσεων[99]. Στην E. coli μια πρωτεΐνη που μοιάζει με ιστόνη και ονομάζεται παράγοντας υποδοχής ενσωμάτωσης (IHF), η οποία συνδέεται με την αλληλουχία ηγέτη, είναι υπεύθυνη για την ακρίβεια αυτής της ενσωμάτωσης[100].Ο IHF ενισχύει επίσης την αποτελεσματικότητα της ενσωμάτωσης στο σύστημα τύπου I-F του Pectobacterium atrosepticum[101], αλλά σε άλλα συστήματα μπορεί να απαιτούνται διαφορετικοί παράγοντες υποδοχής[102].

Παραπομπές

[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]
  1. ↑ Mulepati, Sabin; Héroux, Annie; Bailey, Scott (2014-09-19). «Crystal structure of a CRISPR RNA–guided surveillance complex bound to a ssDNA target» (στα αγγλικά). Science 345 (6203): 1479–1484. doi:10.1126/science.1256996. ISSN 0036-8075. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1256996. 
  2. ↑ Barrangou, Rodolphe (2015-02). «The roles of CRISPR-Cas systems in adaptive immunity and beyond». Current Opinion in Immunology 32: 36–41. doi:10.1016/j.coi.2014.12.008. ISSN 1879-0372. PMID 25574773. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25574773/. 
  3. ↑ Barrangou, Rodolphe (2015-02). «The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond» (στα αγγλικά). Current Opinion in Immunology 32: 36–41. doi:10.1016/j.coi.2014.12.008. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0952791514001563. 
  4. ↑ Redman, Melody; King, Andrew; Watson, Caroline; King, David (2016-08). «What is CRISPR/Cas9?» (στα αγγλικά). Archives of disease in childhood - Education & practice edition 101 (4): 213–215. doi:10.1136/archdischild-2016-310459. ISSN 1743-0585. https://ep.bmj.com/lookup/doi/10.1136/archdischild-2016-310459. 
  5. ↑ 5,0 5,1 Barrangou, Rodolphe; Fremaux, Christophe; Deveau, Hélène; Richards, Melissa; Boyaval, Patrick; Moineau, Sylvain; Romero, Dennis A.; Horvath, Philippe (2007-03-23). «CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes». Science 315 (5819): 1709–1712. doi:10.1126/science.1138140. ISSN 0036-8075. http://dx.doi.org/10.1126/science.1138140. 
  6. ↑ Marraffini, Luciano A.; Sontheimer, Erik J. (2008-12-19). «CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA» (στα αγγλικά). Science 322 (5909): 1843–1845. doi:10.1126/science.1165771. ISSN 0036-8075. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1165771. 
  7. ↑ Bak, Rasmus O.; Gomez-Ospina, Natalia; Porteus, Matthew H. (2018-08). «Gene Editing on Center Stage» (στα αγγλικά). Trends in Genetics 34 (8): 600–611. doi:10.1016/j.tig.2018.05.004. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0168952518300891. 
  8. ↑ Zhang, F.; Wen, Y.; Guo, X. (2014-09-15). «CRISPR/Cas9 for genome editing: progress, implications and challenges» (στα αγγλικά). Human Molecular Genetics 23 (R1): R40–R46. doi:10.1093/hmg/ddu125. ISSN 0964-6906. https://academic.oup.com/hmg/article-lookup/doi/10.1093/hmg/ddu125. 
  9. ↑ Stephens, J.; Barakate, A. (2017), Gene Editing Technologies – ZFNs, TALENs, and CRISPR/Cas9, Elsevier, σελ. 157–161, http://dx.doi.org/10.1016/b978-0-12-394807-6.00242-2, ανακτήθηκε στις 2024-05-03 
  10. ↑ 10,0 10,1 10,2 10,3 10,4 Hsu, Patrick D.; Lander, Eric S.; Zhang, Feng (2014-06). «Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering» (στα αγγλικά). Cell 157 (6): 1262–1278. doi:10.1016/j.cell.2014.05.010. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867414006047. 
  11. ↑ Varga, Máté (2021-02-01). «Kémiai Nobel-díj, 2020 • Nobel Prize in Chemistry, 2020». Magyar Tudomány. doi:10.1556/2065.182.2021.2.8. ISSN 0025-0325. http://dx.doi.org/10.1556/2065.182.2021.2.8. 
  12. ↑ Miller, Johanna L. (2020-12-01). «Charpentier, Doudna win chemistry Nobel for development of CRISPR-Cas genome editing». Physics Today 73 (12): 20–23. doi:10.1063/pt.3.4630. ISSN 0031-9228. http://dx.doi.org/10.1063/pt.3.4630. 
  13. ↑ 13,0 13,1 Rawat, Aadish; Roy, Mrinalini; Jyoti, Anupam; Kaushik, Sanket; Verma, Kuldeep; Srivastava, Vijay Kumar (2021-08). «Cysteine proteases: Battling pathogenic parasitic protozoans with omnipresent enzymes» (στα αγγλικά). Microbiological Research 249: 126784. doi:10.1016/j.micres.2021.126784. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0944501321000902. 
  14. ↑ Ishino, Y; Shinagawa, H; Makino, K; Amemura, M; Nakata, A (1987-12). «Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product» (στα αγγλικά). Journal of Bacteriology 169 (12): 5429–5433. doi:10.1128/jb.169.12.5429-5433.1987. ISSN 0021-9193. https://journals.asm.org/doi/10.1128/jb.169.12.5429-5433.1987. 
  15. ↑ van Soolingen, D; de Haas, P E; Hermans, P W; Groenen, P M; van Embden, J D (1993-08). «Comparison of various repetitive DNA elements as genetic markers for strain differentiation and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis» (στα αγγλικά). Journal of Clinical Microbiology 31 (8): 1987–1995. doi:10.1128/jcm.31.8.1987-1995.1993. ISSN 0095-1137. https://journals.asm.org/doi/10.1128/jcm.31.8.1987-1995.1993. 
  16. ↑ Groenen, Peter M. A.; Bunschoten, Annelies E.; Soolingen, Dick van; Errtbden, Jan D. A. van (1993-12). «Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster of Mycobacterium tuberculosis ; application for strain differentiation by a novel typing method» (στα αγγλικά). Molecular Microbiology 10 (5): 1057–1065. doi:10.1111/j.1365-2958.1993.tb00976.x. ISSN 0950-382X. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2958.1993.tb00976.x. 
  17. ↑ 17,0 17,1 17,2 Mojica, Francisco J.M.; Montoliu, Lluis (2016-10). «On the Origin of CRISPR-Cas Technology: From Prokaryotes to Mammals» (στα αγγλικά). Trends in Microbiology 24 (10): 811–820. doi:10.1016/j.tim.2016.06.005. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0966842X16300683. 
  18. ↑ 18,0 18,1 Mojica, Francisco J. M.; Rodriguez‐Valera, Francisco (2016-09). «The discovery of CRISPR in archaea and bacteria» (στα αγγλικά). The FEBS Journal 283 (17): 3162–3169. doi:10.1111/febs.13766. ISSN 1742-464X. https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/febs.13766. 
  19. ↑ Mojica, Francisco J. M.; Díez‐Villaseñor, Cesar; Soria, Elena; Juez, Guadalupe (2000-04). «Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria» (στα αγγλικά). Molecular Microbiology 36 (1): 244–246. doi:10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x. ISSN 0950-382X. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x. 
  20. ↑ Isaacson, Walter (2021). The code breaker: Jennifer Doudna, gene editing, and the future of the human race. New York: Simon & Schuster. ISBN 978-1-9821-1585-2. 
  21. ↑ Barrangou, Rodolphe· Oost, John van der, επιμ. (2013). CRISPR-Cas systems: RNA-mediated adaptive immunity in bacteria and archaea. Heidelberg ; New York: Springer. ISBN 978-3-642-34656-9. OCLC 813948020. 
  22. ↑ Tang, Thean-Hock; Bachellerie, Jean-Pierre; Rozhdestvensky, Timofey; Bortolin, Marie-Line; Huber, Harald; Drungowski, Mario; Elge, Thorsten; Brosius, Jürgen και άλλοι. (2002-05-28). «Identification of 86 candidates for small non-messenger RNAs from the archaeon Archaeoglobus fulgidus» (στα αγγλικά). Proceedings of the National Academy of Sciences 99 (11): 7536–7541. doi:10.1073/pnas.112047299. ISSN 0027-8424. https://pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.112047299. 
  23. ↑ Charpentier, Emmanuelle; Richter, Hagen; van der Oost, John; White, Malcolm F. (2015-05-01). «Biogenesis pathways of RNA guides in archaeal and bacterial CRISPR-Cas adaptive immunity» (στα αγγλικά). FEMS Microbiology Reviews 39 (3): 428–441. doi:10.1093/femsre/fuv023. ISSN 1574-6976. http://academic.oup.com/femsre/article/39/3/428/2467856/Biogenesis-pathways-of-RNA-guides-in-archaeal-and. 
  24. ↑ 24,0 24,1 Romero, Dennis A; Magill, Damian; Millen, Anne; Horvath, Philippe; Fremaux, Christophe (2020-11-24). «Dairy lactococcal and streptococcal phage–host interactions: an industrial perspective in an evolving phage landscape» (στα αγγλικά). FEMS Microbiology Reviews 44 (6): 909–932. doi:10.1093/femsre/fuaa048. ISSN 1574-6976. https://academic.oup.com/femsre/article/44/6/909/5917986. 
  25. ↑ Jansen, Ruud.; Embden, Jan. D. A. van; Gaastra, Wim.; Schouls, Leo. M. (2002-03). «Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes» (στα αγγλικά). Molecular Microbiology 43 (6): 1565–1575. doi:10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x. ISSN 0950-382X. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x. 
  26. ↑ Pourcel, C.; Salvignol, G.; Vergnaud, G. (2005-03-01). «CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies» (στα αγγλικά). Microbiology 151 (3): 653–663. doi:10.1099/mic.0.27437-0. ISSN 1350-0872. https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/micro/10.1099/mic.0.27437-0. 
  27. ↑ 27,0 27,1 Mojica, Francisco J.M.; D�ez-Villase�or, Chc)sar; Garc�a-Mart�nez, Jes�s; Soria, Elena (2005-02). «Intervening Sequences of Regularly Spaced Prokaryotic Repeats Derive from Foreign Genetic Elements» (στα αγγλικά). Journal of Molecular Evolution 60 (2): 174–182. doi:10.1007/s00239-004-0046-3. ISSN 0022-2844. http://link.springer.com/10.1007/s00239-004-0046-3. 
  28. ↑ Bolotin, Alexander; Quinquis, Benoit; Sorokin, Alexei; Ehrlich, S. Dusko (2005-08-01). «Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin» (στα αγγλικά). Microbiology 151 (8): 2551–2561. doi:10.1099/mic.0.28048-0. ISSN 1350-0872. https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/micro/10.1099/mic.0.28048-0. 
  29. ↑ Horvath, Philippe; Barrangou, Rodolphe (2010-01-08). «CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea» (στα αγγλικά). Science 327 (5962): 167–170. doi:10.1126/science.1179555. ISSN 0036-8075. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1179555. 
  30. ↑ Morange, Michel (2015-06). «What history tells us XXXVII. CRISPR-Cas: The discovery of an immune system in prokaryotes» (στα αγγλικά). Journal of Biosciences 40 (2): 221–223. doi:10.1007/s12038-015-9532-6. ISSN 0250-5991. http://link.springer.com/10.1007/s12038-015-9532-6. 
  31. ↑ Lander, Eric S. (2016-01). «The Heroes of CRISPR» (στα αγγλικά). Cell 164 (1-2): 18–28. doi:10.1016/j.cell.2015.12.041. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867415017055. 
  32. ↑ Makarova, Kira S; Grishin, Nick V; Shabalina, Svetlana A; Wolf, Yuri I; Koonin, Eugene V (2006-12). «A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action» (στα αγγλικά). Biology Direct 1 (1). doi:10.1186/1745-6150-1-7. ISSN 1745-6150. https://biologydirect.biomedcentral.com/articles/10.1186/1745-6150-1-7. 
  33. ↑ Pennisi, Elizabeth (2013-08-23). «The CRISPR Craze» (στα αγγλικά). Science 341 (6148): 833–836. doi:10.1126/science.341.6148.833. ISSN 0036-8075. https://www.science.org/doi/10.1126/science.341.6148.833. 
  34. ↑ 34,0 34,1 34,2 Marraffini, Luciano A. (2015-10-01). «CRISPR-Cas immunity in prokaryotes» (στα αγγλικά). Nature 526 (7571): 55–61. doi:10.1038/nature15386. ISSN 0028-0836. https://www.nature.com/articles/nature15386. 
  35. ↑ Brouns, Stan J. J.; Jore, Matthijs M.; Lundgren, Magnus; Westra, Edze R.; Slijkhuis, Rik J. H.; Snijders, Ambrosius P. L.; Dickman, Mark J.; Makarova, Kira S. και άλλοι. (2008-08-15). «Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes» (στα αγγλικά). Science 321 (5891): 960–964. doi:10.1126/science.1159689. ISSN 0036-8075. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1159689. 
  36. ↑ Garneau, Josiane E.; Dupuis, Marie-Ève; Villion, Manuela; Romero, Dennis A.; Barrangou, Rodolphe; Boyaval, Patrick; Fremaux, Christophe; Horvath, Philippe και άλλοι. (2010-11-04). «The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA» (στα αγγλικά). Nature 468 (7320): 67–71. doi:10.1038/nature09523. ISSN 0028-0836. https://www.nature.com/articles/nature09523. 
  37. ↑ Deltcheva, Elitza; Chylinski, Krzysztof; Sharma, Cynthia M.; Gonzales, Karine; Chao, Yanjie; Pirzada, Zaid A.; Eckert, Maria R.; Vogel, Jörg και άλλοι. (2011-03). «CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III» (στα αγγλικά). Nature 471 (7340): 602–607. doi:10.1038/nature09886. ISSN 0028-0836. https://www.nature.com/articles/nature09886. 
  38. ↑ Barrangou, Rodolphe (2015-12). «Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines» (στα αγγλικά). Genome Biology 16 (1). doi:10.1186/s13059-015-0816-9. ISSN 1474-760X. https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-015-0816-9. 
  39. ↑ Jinek, Martin; Chylinski, Krzysztof; Fonfara, Ines; Hauer, Michael; Doudna, Jennifer A.; Charpentier, Emmanuelle (2012-08-17). «A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity» (στα αγγλικά). Science 337 (6096): 816–821. doi:10.1126/science.1225829. ISSN 0036-8075. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1225829. 
  40. ↑ Cong, Le; Ran, F. Ann; Cox, David; Lin, Shuailiang; Barretto, Robert; Habib, Naomi; Hsu, Patrick D.; Wu, Xuebing και άλλοι. (2013-02-15). «Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems» (στα αγγλικά). Science 339 (6121): 819–823. doi:10.1126/science.1231143. ISSN 0036-8075. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1231143. 
  41. ↑ Mali, Prashant; Yang, Luhan; Esvelt, Kevin M.; Aach, John; Guell, Marc; DiCarlo, James E.; Norville, Julie E.; Church, George M. (2013-02-15). «RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9» (στα αγγλικά). Science 339 (6121): 823–826. doi:10.1126/science.1232033. ISSN 0036-8075. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1232033. 
  42. ↑ DiCarlo, James E.; Norville, Julie E.; Mali, Prashant; Rios, Xavier; Aach, John; Church, George M. (2013-04-01). «Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems» (στα αγγλικά). Nucleic Acids Research 41 (7): 4336–4343. doi:10.1093/nar/gkt135. ISSN 1362-4962. https://academic.oup.com/nar/article/41/7/4336/1075252. 
  43. ↑ Zhang, Guo-Chang; Kong, In Iok; Kim, Heejin; Liu, Jing-Jing; Cate, Jamie H. D.; Jin, Yong-Su (2014-12-15). Schottel, J. L., επιμ. «Construction of a Quadruple Auxotrophic Mutant of an Industrial Polyploid Saccharomyces cerevisiae Strain by Using RNA-Guided Cas9 Nuclease» (στα αγγλικά). Applied and Environmental Microbiology 80 (24): 7694–7701. doi:10.1128/AEM.02310-14. ISSN 0099-2240. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.02310-14. 
  44. ↑ Liu, Jing-Jing; Kong, In Iok; Zhang, Guo-Chang; Jayakody, Lahiru N.; Kim, Heejin; Xia, Peng-Fei; Kwak, Suryang; Sung, Bong Hyun και άλλοι. (2016-04-15). Brakhage, A. A., επιμ. «Metabolic Engineering of Probiotic Saccharomyces boulardii» (στα αγγλικά). Applied and Environmental Microbiology 82 (8): 2280–2287. doi:10.1128/AEM.00057-16. ISSN 0099-2240. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.00057-16. 
  45. ↑ Vyas, Valmik K.; Barrasa, M. Inmaculada; Fink, Gerald R. (2015-04-03). «A Candida albicans CRISPR system permits genetic engineering of essential genes and gene families» (στα αγγλικά). Science Advances 1 (3). doi:10.1126/sciadv.1500248. ISSN 2375-2548. https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.1500248. 
  46. ↑ Ng, Henry; Dean, Neta (2017-04-26). Lorenz, Michael, επιμ. «Dramatic Improvement of CRISPR/Cas9 Editing in Candida albicans by Increased Single Guide RNA Expression» (στα αγγλικά). mSphere 2 (2). doi:10.1128/mSphere.00385-16. ISSN 2379-5042. https://journals.asm.org/doi/10.1128/mSphere.00385-16. 
  47. ↑ Hwang, Woong Y; Fu, Yanfang; Reyon, Deepak; Maeder, Morgan L; Tsai, Shengdar Q; Sander, Jeffry D; Peterson, Randall T; Yeh, J-R Joanna και άλλοι. (2013-03). «Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system» (στα αγγλικά). Nature Biotechnology 31 (3): 227–229. doi:10.1038/nbt.2501. ISSN 1087-0156. https://www.nature.com/articles/nbt.2501. 
  48. ↑ Gratz, Scott J; Cummings, Alexander M; Nguyen, Jennifer N; Hamm, Danielle C; Donohue, Laura K; Harrison, Melissa M; Wildonger, Jill; O’Connor-Giles, Kate M (2013-08-01). «Genome Engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-Guided Cas9 Nuclease» (στα αγγλικά). Genetics 194 (4): 1029–1035. doi:10.1534/genetics.113.152710. ISSN 1943-2631. https://academic.oup.com/genetics/article/194/4/1029/5935344. 
  49. ↑ Bassett, Andrew R.; Tibbit, Charlotte; Ponting, Chris P.; Liu, Ji-Long (2013-07). «Highly Efficient Targeted Mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 System» (στα αγγλικά). Cell Reports 4 (1): 220–228. doi:10.1016/j.celrep.2013.06.020. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S2211124713003124. 
  50. ↑ Yan, Hua; Opachaloemphan, Comzit; Mancini, Giacomo; Yang, Huan; Gallitto, Matthew; Mlejnek, Jakub; Leibholz, Alexandra; Haight, Kevin και άλλοι. (2017-08). «An Engineered orco Mutation Produces Aberrant Social Behavior and Defective Neural Development in Ants» (στα αγγλικά). Cell 170 (4): 736–747.e9. doi:10.1016/j.cell.2017.06.051. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867417307705. 
  51. ↑ Trible, Waring; Olivos-Cisneros, Leonora; McKenzie, Sean K.; Saragosti, Jonathan; Chang, Ni-Chen; Matthews, Benjamin J.; Oxley, Peter R.; Kronauer, Daniel J.C. (2017-08). «orco Mutagenesis Causes Loss of Antennal Lobe Glomeruli and Impaired Social Behavior in Ants» (στα αγγλικά). Cell 170 (4): 727–735.e10. doi:10.1016/j.cell.2017.07.001. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867417307729. 
  52. ↑ Kistler, Kathryn E.; Vosshall, Leslie B.; Matthews, Benjamin J. (2015-04). «Genome Engineering with CRISPR-Cas9 in the Mosquito Aedes aegypti» (στα αγγλικά). Cell Reports 11 (1): 51–60. doi:10.1016/j.celrep.2015.03.009. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S2211124715002624. 
  53. ↑ Friedland, Ari E; Tzur, Yonatan B; Esvelt, Kevin M; Colaiácovo, Monica P; Church, George M; Calarco, John A (2013-08). «Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system» (στα αγγλικά). Nature Methods 10 (8): 741–743. doi:10.1038/nmeth.2532. ISSN 1548-7091. https://www.nature.com/articles/nmeth.2532. 
  54. ↑ Jiang, Wenzhi; Zhou, Huanbin; Bi, Honghao; Fromm, Michael; Yang, Bing; Weeks, Donald P. (2013-11-01). «Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice» (στα αγγλικά). Nucleic Acids Research 41 (20): e188–e188. doi:10.1093/nar/gkt780. ISSN 1362-4962. https://academic.oup.com/nar/article/41/20/e188/2414851. 
  55. ↑ Wang, Haoyi; Yang, Hui; Shivalila, Chikdu S.; Dawlaty, Meelad M.; Cheng, Albert W.; Zhang, Feng; Jaenisch, Rudolf (2013-05). «One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering» (στα αγγλικά). Cell 153 (4): 910–918. doi:10.1016/j.cell.2013.04.025. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867413004674. 
  56. ↑ Soni, Dheeraj; Wang, Dong-Mei; Regmi, Sushil C.; Mittal, Manish; Vogel, Stephen M.; Schlüter, Dirk; Tiruppathi, Chinnaswamy (2018-05-16). «Deubiquitinase function of A20 maintains and repairs endothelial barrier after lung vascular injury» (στα αγγλικά). Cell Death Discovery 4 (1). doi:10.1038/s41420-018-0056-3. ISSN 2058-7716. https://www.nature.com/articles/s41420-018-0056-3. 
  57. ↑ Guo, Xiangyu; Li, Xiao-Jiang (2015-07). «Targeted genome editing in primate embryos» (στα αγγλικά). Cell Research 25 (7): 767–768. doi:10.1038/cr.2015.64. ISSN 1001-0602. https://www.nature.com/articles/cr201564. 
  58. ↑ Baltimore, David; Berg, Paul; Botchan, Michael; Carroll, Dana; Charo, R. Alta; Church, George; Corn, Jacob E.; Daley, George Q. και άλλοι. (2015-04-03). «A prudent path forward for genomic engineering and germline gene modification» (στα αγγλικά). Science 348 (6230): 36–38. doi:10.1126/science.aab1028. ISSN 0036-8075. https://www.science.org/doi/10.1126/science.aab1028. 
  59. ↑ Larson, Matthew H; Gilbert, Luke A; Wang, Xiaowo; Lim, Wendell A; Weissman, Jonathan S; Qi, Lei S (2013-11). «CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression» (στα αγγλικά). Nature Protocols 8 (11): 2180–2196. doi:10.1038/nprot.2013.132. ISSN 1754-2189. https://www.nature.com/articles/nprot.2013.132. 
  60. ↑ Liang, Puping; Xu, Yanwen; Zhang, Xiya; Ding, Chenhui; Huang, Rui; Zhang, Zhen; Lv, Jie; Xie, Xiaowei και άλλοι. (2015-05). «CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes» (στα αγγλικά). Protein & Cell 6 (5): 363–372. doi:10.1007/s13238-015-0153-5. ISSN 1674-800X. https://academic.oup.com/proteincell/article/6/5/363/6803432. 
  61. ↑ Yan, Mei-Yi; Yan, Hai-Qin; Ren, Gai-Xian; Zhao, Ju-Ping; Guo, Xiao-Peng; Sun, Yi-Cheng (2017-09). Müller, Volker, επιμ. «CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria» (στα αγγλικά). Applied and Environmental Microbiology 83 (17). doi:10.1128/AEM.00947-17. ISSN 0099-2240. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.00947-17. 
  62. ↑ Zetsche, Bernd; Gootenberg, Jonathan S.; Abudayyeh, Omar O.; Slaymaker, Ian M.; Makarova, Kira S.; Essletzbichler, Patrick; Volz, Sara E.; Joung, Julia και άλλοι. (2015-10). «Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System» (στα αγγλικά). Cell 163 (3): 759–771. doi:10.1016/j.cell.2015.09.038. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867415012003. 
  63. ↑ Fonfara, Ines; Richter, Hagen; Bratovič, Majda; Le Rhun, Anaïs; Charpentier, Emmanuelle (2016-04). «The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA» (στα αγγλικά). Nature 532 (7600): 517–521. doi:10.1038/nature17945. ISSN 0028-0836. https://www.nature.com/articles/nature17945. 
  64. ↑ Kim, Hyeran; Kim, Sang-Tae; Ryu, Jahee; Kang, Beum-Chang; Kim, Jin-Soo; Kim, Sang-Gyu (2017-02-16). «CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing» (στα αγγλικά). Nature Communications 8 (1). doi:10.1038/ncomms14406. ISSN 2041-1723. https://www.nature.com/articles/ncomms14406. 
  65. ↑ Miao, Chensi· Zhao, Huiwei· Qian, Long· Lou, Chunbo (9 Απριλίου 2018). «Systematically investigating the key features of the nuclease deactivated Cpf1 for tunable multiplex genetic regulation». dx.doi.org. Ανακτήθηκε στις 3 Μαΐου 2024. 
  66. ↑ Chen, Janice S.; Ma, Enbo; Harrington, Lucas B.; Da Costa, Maria; Tian, Xinran; Palefsky, Joel M.; Doudna, Jennifer A. (2018-04-27). «CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity» (στα αγγλικά). Science 360 (6387): 436–439. doi:10.1126/science.aar6245. ISSN 0036-8075. https://www.science.org/doi/10.1126/science.aar6245. 
  67. ↑ Broughton, James P.; Deng, Xianding; Yu, Guixia; Fasching, Clare L.; Servellita, Venice; Singh, Jasmeet; Miao, Xin; Streithorst, Jessica A. και άλλοι. (2020-07). «CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2» (στα αγγλικά). Nature Biotechnology 38 (7): 870–874. doi:10.1038/s41587-020-0513-4. ISSN 1087-0156. https://www.nature.com/articles/s41587-020-0513-4. 
  68. ↑ Nguyen, Long T.; Smith, Brianna M.; Jain, Piyush K. (2020-09-30). «Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection» (στα αγγλικά). Nature Communications 11 (1). doi:10.1038/s41467-020-18615-1. ISSN 2041-1723. https://www.nature.com/articles/s41467-020-18615-1. 
  69. ↑ Abudayyeh, Omar O.; Gootenberg, Jonathan S.; Konermann, Silvana; Joung, Julia; Slaymaker, Ian M.; Cox, David B. T.; Shmakov, Sergey; Makarova, Kira S. και άλλοι. (2016-08-05). «C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector» (στα αγγλικά). Science 353 (6299). doi:10.1126/science.aaf5573. ISSN 0036-8075. https://www.science.org/doi/10.1126/science.aaf5573. 
  70. ↑ Gootenberg, Jonathan S.; Abudayyeh, Omar O.; Lee, Jeong Wook; Essletzbichler, Patrick; Dy, Aaron J.; Joung, Julia; Verdine, Vanessa; Donghia, Nina και άλλοι. (2017-04-28). «Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2» (στα αγγλικά). Science 356 (6336): 438–442. doi:10.1126/science.aam9321. ISSN 0036-8075. https://www.science.org/doi/10.1126/science.aam9321. 
  71. ↑ Gootenberg, Jonathan S.; Abudayyeh, Omar O.; Kellner, Max J.; Joung, Julia; Collins, James J.; Zhang, Feng (2018-04-27). «Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6» (στα αγγλικά). Science 360 (6387): 439–444. doi:10.1126/science.aaq0179. ISSN 0036-8075. https://www.science.org/doi/10.1126/science.aaq0179. 
  72. ↑ Iwasaki, Roman S; Batey, Robert T (2020-09-25). «SPRINT: a Cas13a-based platform for detection of small molecules» (στα αγγλικά). Nucleic Acids Research 48 (17): e101–e101. doi:10.1093/nar/gkaa673. ISSN 0305-1048. https://academic.oup.com/nar/article/48/17/e101/5892748. 
  73. ↑ Mahas, Ahmed; Wang, Qiaochu; Marsic, Tin; Mahfouz, Magdy M. (2021-10-15). «A Novel Miniature CRISPR-Cas13 System for SARS-CoV-2 Diagnostics» (στα αγγλικά). ACS Synthetic Biology 10 (10): 2541–2551. doi:10.1021/acssynbio.1c00181. ISSN 2161-5063. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.1c00181. 
  74. ↑ Hille, Frank; Charpentier, Emmanuelle (2016-11-05). «CRISPR-Cas: biology, mechanisms and relevance» (στα αγγλικά). Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 371 (1707): 20150496. doi:10.1098/rstb.2015.0496. ISSN 0962-8436. https://royalsocietypublishing.org/doi/10.1098/rstb.2015.0496. 
  75. ↑ 75,0 75,1 75,2 Barrangou, Rodolphe; Marraffini, Luciano A. (2014-04). «CRISPR-Cas Systems: Prokaryotes Upgrade to Adaptive Immunity» (στα αγγλικά). Molecular Cell 54 (2): 234–244. doi:10.1016/j.molcel.2014.03.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1097276514002160. 
  76. ↑ Tyson, Gene W.; Banfield, Jillian F. (2008-01). «Rapidly evolving CRISPRs implicated in acquired resistance of microorganisms to viruses» (στα αγγλικά). Environmental Microbiology 10 (1): 200–207. doi:10.1111/j.1462-2920.2007.01444.x. ISSN 1462-2912. https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1462-2920.2007.01444.x. 
  77. ↑ 77,0 77,1 Koonin, Eugene V.; Makarova, Kira S. (2019-05-13). «Origins and evolution of CRISPR-Cas systems» (στα αγγλικά). Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 374 (1772): 20180087. doi:10.1098/rstb.2018.0087. ISSN 0962-8436. https://royalsocietypublishing.org/doi/10.1098/rstb.2018.0087. 
  78. ↑ Wright, Addison V.; Nuñez, James K.; Doudna, Jennifer A. (2016-01). «Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature’s Toolbox for Genome Engineering» (στα αγγλικά). Cell 164 (1-2): 29–44. doi:10.1016/j.cell.2015.12.035. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867415016992. 
  79. ↑ Westra, Edze R.; Dowling, Andrea J.; Broniewski, Jenny M.; van Houte, Stineke (2016-11-01). «Evolution and Ecology of CRISPR» (στα αγγλικά). Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 47 (1): 307–331. doi:10.1146/annurev-ecolsys-121415-032428. ISSN 1543-592X. https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev-ecolsys-121415-032428. 
  80. ↑ Makarova, Kira S.; Wolf, Yuri I.; Alkhnbashi, Omer S.; Costa, Fabrizio; Shah, Shiraz A.; Saunders, Sita J.; Barrangou, Rodolphe; Brouns, Stan J. J. και άλλοι. (2015-11). «An updated evolutionary classification of CRISPR–Cas systems» (στα αγγλικά). Nature Reviews Microbiology 13 (11): 722–736. doi:10.1038/nrmicro3569. ISSN 1740-1526. https://www.nature.com/articles/nrmicro3569. 
  81. ↑ 81,0 81,1 Wiedenheft, Blake; Sternberg, Samuel H.; Doudna, Jennifer A. (2012-02). «RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea» (στα αγγλικά). Nature 482 (7385): 331–338. doi:10.1038/nature10886. ISSN 0028-0836. https://www.nature.com/articles/nature10886. 
  82. ↑ Deng, Ling; Garrett, Roger A.; Shah, Shiraz A.; Peng, Xu; She, Qunxin (2013-03). «A novel interference mechanism by a type IIIB CRISPR ‐ Cmr module in S ulfolobus» (στα αγγλικά). Molecular Microbiology 87 (5): 1088–1099. doi:10.1111/mmi.12152. ISSN 0950-382X. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/mmi.12152. 
  83. ↑ Azangou-Khyavy, Mohammadreza; Ghasemi, Mobina; Khanali, Javad; Boroomand-Saboor, Melika; Jamalkhah, Monire; Soleimani, Masoud; Kiani, Jafar (2020-09-29). «CRISPR/Cas: From Tumor Gene Editing to T Cell-Based Immunotherapy of Cancer». Frontiers in Immunology 11. doi:10.3389/fimmu.2020.02062. ISSN 1664-3224. https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2020.02062/full. 
  84. ↑ Aliyari, Roghiyh; Ding, Shou‐Wei (2009-01). «RNA‐based viral immunity initiated by the Dicer family of host immune receptors» (στα αγγλικά). Immunological Reviews 227 (1): 176–188. doi:10.1111/j.1600-065X.2008.00722.x. ISSN 0105-2896. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-065X.2008.00722.x. 
  85. ↑ Dugar, Gaurav; Herbig, Alexander; Förstner, Konrad U.; Heidrich, Nadja; Reinhardt, Richard; Nieselt, Kay; Sharma, Cynthia M. (2013-05-16). Hughes, Diarmaid, επιμ. «High-Resolution Transcriptome Maps Reveal Strain-Specific Regulatory Features of Multiple Campylobacter jejuni Isolates» (στα αγγλικά). PLoS Genetics 9 (5): e1003495. doi:10.1371/journal.pgen.1003495. ISSN 1553-7404. https://dx.plos.org/10.1371/journal.pgen.1003495. 
  86. ↑ Hatoum-Aslan, Asma; Maniv, Inbal; Marraffini, Luciano A. (2011-12-27). «Mature clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats RNA (crRNA) length is measured by a ruler mechanism anchored at the precursor processing site» (στα αγγλικά). Proceedings of the National Academy of Sciences 108 (52): 21218–21222. doi:10.1073/pnas.1112832108. ISSN 0027-8424. https://pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.1112832108. 
  87. ↑ Yosef, Ido; Goren, Moran G.; Qimron, Udi (2012-07-01). «Proteins and DNA elements essential for the CRISPR adaptation process in Escherichia coli» (στα αγγλικά). Nucleic Acids Research 40 (12): 5569–5576. doi:10.1093/nar/gks216. ISSN 1362-4962. https://academic.oup.com/nar/article/40/12/5569/2414832. 
  88. ↑ Swarts, Daan C.; Mosterd, Cas; van Passel, Mark W. J.; Brouns, Stan J. J. (2012-04-27). Mokrousov, Igor, επιμ. «CRISPR Interference Directs Strand Specific Spacer Acquisition» (στα αγγλικά). PLoS ONE 7 (4): e35888. doi:10.1371/journal.pone.0035888. ISSN 1932-6203. https://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0035888. 
  89. ↑ Babu, Mohan; Beloglazova, Natalia; Flick, Robert; Graham, Chris; Skarina, Tatiana; Nocek, Boguslaw; Gagarinova, Alla; Pogoutse, Oxana και άλλοι. (2011-01). «A dual function of the CRISPR–Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair» (στα αγγλικά). Molecular Microbiology 79 (2): 484–502. doi:10.1111/j.1365-2958.2010.07465.x. ISSN 0950-382X. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2958.2010.07465.x. 
  90. ↑ Han, Dong; Lehmann, Kathleen; Krauss, Gerhard (2009-06-18). «SSO1450 – A CAS1 protein from Sulfolobus solfataricus P2 with high affinity for RNA and DNA» (στα αγγλικά). FEBS Letters 583 (12): 1928–1932. doi:10.1016/j.febslet.2009.04.047. ISSN 0014-5793. https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1016/j.febslet.2009.04.047. 
  91. ↑ Wiedenheft, Blake; Zhou, Kaihong; Jinek, Martin; Coyle, Scott M.; Ma, Wendy; Doudna, Jennifer A. (2009-06). «Structural Basis for DNase Activity of a Conserved Protein Implicated in CRISPR-Mediated Genome Defense» (στα αγγλικά). Structure 17 (6): 904–912. doi:10.1016/j.str.2009.03.019. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0969212609001920. 
  92. ↑ Beloglazova, Natalia; Brown, Greg; Zimmerman, Matthew D.; Proudfoot, Michael; Makarova, Kira S.; Kudritska, Marina; Kochinyan, Samvel; Wang, Shuren και άλλοι. (2008-07). «A Novel Family of Sequence-specific Endoribonucleases Associated with the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats» (στα αγγλικά). Journal of Biological Chemistry 283 (29): 20361–20371. doi:10.1074/jbc.M803225200. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0021925820596919. 
  93. ↑ Samai, Poulami; Smith, Paul; Shuman, Stewart (2010-12-01). «Structure of a CRISPR-associated protein Cas2 from Desulfovibrio vulgaris». Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications 66 (12): 1552–1556. doi:10.1107/S1744309110039801. ISSN 1744-3091. https://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S1744309110039801. 
  94. ↑ Nam, Ki Hyun; Ding, Fran; Haitjema, Charles; Huang, Qingqiu; DeLisa, Matthew P.; Ke, Ailong (2012-10). «Double-stranded Endonuclease Activity in Bacillus halodurans Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated Cas2 Protein» (στα αγγλικά). Journal of Biological Chemistry 287 (43): 35943–35952. doi:10.1074/jbc.M112.382598. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0021925820625704. 
  95. ↑ 95,0 95,1 Nuñez, James K; Kranzusch, Philip J; Noeske, Jonas; Wright, Addison V; Davies, Christopher W; Doudna, Jennifer A (2014-06). «Cas1–Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRISPR–Cas adaptive immunity» (στα αγγλικά). Nature Structural & Molecular Biology 21 (6): 528–534. doi:10.1038/nsmb.2820. ISSN 1545-9993. https://www.nature.com/articles/nsmb.2820. 
  96. ↑ Nuñez, James K.; Lee, Amy S. Y.; Engelman, Alan; Doudna, Jennifer A. (2015-03-12). «Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR–Cas adaptive immunity» (στα αγγλικά). Nature 519 (7542): 193–198. doi:10.1038/nature14237. ISSN 0028-0836. https://www.nature.com/articles/nature14237. 
  97. ↑ Wang, Jiuyu; Li, Jiazhi; Zhao, Hongtu; Sheng, Gang; Wang, Min; Yin, Maolu; Wang, Yanli (2015-11). «Structural and Mechanistic Basis of PAM-Dependent Spacer Acquisition in CRISPR-Cas Systems» (στα αγγλικά). Cell 163 (4): 840–853. doi:10.1016/j.cell.2015.10.008. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867415013215. 
  98. ↑ Nuñez, James K.; Harrington, Lucas B.; Kranzusch, Philip J.; Engelman, Alan N.; Doudna, Jennifer A. (2015-11). «Foreign DNA capture during CRISPR–Cas adaptive immunity» (στα αγγλικά). Nature 527 (7579): 535–538. doi:10.1038/nature15760. ISSN 0028-0836. https://www.nature.com/articles/nature15760. 
  99. ↑ Sorek, Rotem; Lawrence, C. Martin; Wiedenheft, Blake (2013-06-02). «CRISPR-Mediated Adaptive Immune Systems in Bacteria and Archaea» (στα αγγλικά). Annual Review of Biochemistry 82 (1): 237–266. doi:10.1146/annurev-biochem-072911-172315. ISSN 0066-4154. https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev-biochem-072911-172315. 
  100. ↑ Nuñez, James K.; Bai, Lawrence; Harrington, Lucas B.; Hinder, Tracey L.; Doudna, Jennifer A. (2016-06). «CRISPR Immunological Memory Requires a Host Factor for Specificity» (στα αγγλικά). Molecular Cell 62 (6): 824–833. doi:10.1016/j.molcel.2016.04.027. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1097276516301034. 
  101. ↑ Fagerlund, Robert D.; Wilkinson, Max E.; Klykov, Oleg; Barendregt, Arjan; Pearce, F. Grant; Kieper, Sebastian N.; Maxwell, Howard W. R.; Capolupo, Angela και άλλοι. (2017-06-27). «Spacer capture and integration by a type I-F Cas1–Cas2-3 CRISPR adaptation complex» (στα αγγλικά). Proceedings of the National Academy of Sciences 114 (26). doi:10.1073/pnas.1618421114. ISSN 0027-8424. https://pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.1618421114. 
  102. ↑ Rollie, Clare; Graham, Shirley; Rouillon, Christophe; White, Malcolm F (2018-02-16). «Prespacer processing and specific integration in a Type I-A CRISPR system» (στα αγγλικά). Nucleic Acids Research 46 (3): 1007–1020. doi:10.1093/nar/gkx1232. ISSN 0305-1048. https://academic.oup.com/nar/article/46/3/1007/4705969.