En el estrato espinoso los queratinocitos poliédricos se unen mediante desmosomas. Su aspecto espinoso se debe a la contracción de los microfilamentos entre los desmosomas que se produce cuando se tiñen con tinción hematoxilina-eosina. La queratinización comienza en el estrato espinoso,[5] aunque los queratinocitos reales comienzan en el estrato basal.
Tienen núcleos grandes que se tiñen de color pálido, ya que son activos en la síntesis de proteínas fibrilares, conocidas como citoqueratina, que se acumulan dentro de las células y se agregan para formar tonofibrillas. Las tonofibrillas pasan a formar los desmosomas, que permiten que se formen fuertes conexiones entre los queratinocitos adyacentes. El estrato espinoso también contiene células de Langerhans.[6][7]
La hiperplasia difusa del estrato espinoso se denomina acantosis. Esto implica un mayor espesor de la capa de Malpighi (estrato basal y estrato espinoso), que en la mayoría de los casos se asocia con un aumento del número de queratinocitos.