Pöördtranskriptaas

Pöördtranskriptaas on ensüüm, mille abil sünteesitakse RNA matriitsahelalt komplementaarne DNA (cDNA) ahel. Seda protsessi nimetatakse pöördtranskriptsiooniks ning valdavalt seostatakse seda retroviirustega. Lisaks retroviirustele kasutavad pöördtranskriptaasi ka mõned teised viirused, näiteks B-hepatiidi viirus, mis kuulub sugukonda Hepadnaviridae. Sellepärast on pöördtranskriptaasi inhibeerivad ühendid laialdaselt kasutusel antiretroviraalsete ravimitena. Pöördtranskriptaasi on seostatud ka kromosoomide otsade ehk telomeeride replikatsiooni protsessiga ning osade mobiilsete geneetiliste elementidega (retrotransposoonid).

Pöördtranskriptsiooni kasutatakse laialdaselt molekulaarses kloneerimises RNA-lt DNA saamiseks, RNA sekveneerimises, polümeraasi ahelreaktsioonis (PCR) või genoomses analüüsis.

Enim uuritud pöördtranskriptaasid:

  • HIV-1 pöördtranksriptaas, mis on pärit inimese immuunpuudulikkuse tüüp 1 viiruselt ning koosneb kahest subühikust molekulmassidega 66 kDA ja 51 kDa.[1]
  • M-MLV pöördtranskriptaas Moloney hiire leukeemia viirusest, mis esineb üksiku 75 kDa-lise monomeerina. [2]
  • AMV pöördtranskriptaas linnu müeloblastoosi viirusest, mis koosneb samuti kahest subühikust,molekulmassidega 63 kDa ja 95 kDa.
  • Telomeraasi pöördtranskriptaas, mis säilitab telomeere replikatsiooni käigus.

Ajalugu

[muuda | muuda lähteteksti]

Pöördtranskriptaasi avastas Howard Temin Wisconsini ülikoolis respiratoor-süntsütiaalse viiruse (RSV) virionidest [3] ning David Baltimore isoleeris selle 1970. aastal kahest RNA kasvajaviirusest: R-MLV ja samuti RSV.[4] Nende saavutuste eest anti neile 1975. aastal ühine Nobeli auhind füsioloogia või meditsiini kategoorias (koos Renato Dulbeccoga). Alguses oli idee pöördtranskriptsioonist väga ebapopulaarne, kuna see oli vastuolus molekulaarbioloogia keskse dogmaga, mis väidab, et DNA-d transkribeeritakse RNA-ks ning seda omakorda valguks. Alles pärast pöördtranskriptaasi avastamist hakati aktsepteerima ideed, et geneetilist informatsiooni on võimalik üle kanda ka RNA-lt DNA-le.[5]

Pöördtranskriptaas viirustes

[muuda | muuda lähteteksti]

Pöördtranskriptaasi kasutavad viirused replikatsioonil. Pöördtranskribeerivad RNA-viirused (näiteks HI-viirus) kasutavad ensüümi, et pöördtranskribeerida oma RNA genoom DNA-ks. Saadud DNA on võimalik seejärel integreerida peremeesorganismi genoomi ning läbi selle saab viirus enda genoomi replitseerida. Pöördtranskribeerides DNA-viiruseid, näiteks hepadnaviirust, on võimalik kasutada saadud RNA-d matriitsahelana uute DNA ahelate kokkupanemisel. Pöördtranskriptaasi puudumisel ei oleks viirused võimelised enda genoomi replitseerima.[6]

Pöördtranskriptsiooni protsess

[muuda | muuda lähteteksti]

Pöördtranskriptaas kasutab RNA matriitsahelat, et sünteesida kaheahelaline DNA. Viirustes, kus pöördtranskriptaasil on puudu DNA-sõltuv DNA polümeraasne aktiivsus, on võimalus, et kaheahelalist DNA-d sünteesitakse peremeesorganismi kodeeritud DNA polümeraas δ abil. Polümeraas tuvastab ekslikult viraalse DNA-RNA kui praimeri ning sünteesib kaheahelalise DNA samal mehhanismil nagu praimeri eemaldamiselgi, kus uus sünteesitud ahel vahetab välja algse RNA matriitsahela. Pöördtranskriptsiooni puhul on vigade ehk mutatsioonide tekkimise tõenäosus suur. Need mutatsoonid võivad põhjustada ravimiresistentsust.[7]

Retroviiruste pöördtranskriptsioon

[muuda | muuda lähteteksti]

Retroviirused kasutavad pöördtranskriptaasi üheahelalise genoomse RNA transkribeerimiseks kaheahelaliseks cDNA-ks, et see integreerida peremeesgenoomi. Nende genoom koosneb kahest positiivse laenguga üheahelalisest RNA molekulist (ss-RNA ehk single-stranded RNA), millel on 5’-cap ja 3’-polüadenenüleeritud saba. Retroviirusteks on näiteks inimese immuunpuudulikkuse viirus (HIV) ja inimese T-lümfotroopne viirus (HTLV). Kaheahelalise DNA süntees toimub tsütosoolis [6] järgmiste protsesside tulemusena:

Pöördtranskriptsiooni mehhanism VI klassi ssRNA-RT HI-viiruses
  1. Spetsiifiline tRNA käitub kui praimer ning hübridiseerub viiruse RNA genoomi komplementaarsesse piirkonda, mida kutsutakse praimeri seondumisala (PBS ehk primer binding site).
  2. Seejärel lisab pöördtranskriptaas praimeri 3' otsa DNA nukleotiide, sünteesides nii DNA, mis on komplementaarne RNA U5 (mittekodeeriv ala) ja R regiooniga (otsene kordusjärjestus RNA molekuli mõlemas otsas).
  3. Pöördtranskriptaasil on domeen nimega RNaas H, mis lagundab U5 JA R regiooni RNA 5’-otsas.
  4. Praimer seob viraalse genoomi 3’-otsa ning äsja sünteesitud DNA ahelad hübridiseeruvad RNA komplementaarse R regiooniga.
  5. Sünteesitud komplementaarne DNA (cDNA) pikendatakse ning enamus viraalsest RNA-st lagundatakse RNaas H abil.
  6. Lagundamata viraalne RNA toimib praimerina DNA teise ahela sünteesil.
  7. Toimub "hüpe", kus teiselt ahela PBS hübridiseerub esimese ahela komplementaarse PBS-järjestusega.
  8. Mõlemad ahelad pikendatakse, et moodustada täielik kaksikahelaline DNA, mida on võimalik integraasi abil integreerida peremeesorganismi genoomi.

Kaheahelalise DNA sünteesi käigus toimub ka ahela ülekanne, mil lühike DNA (algse RNA-sõltuva DNA sünteesi produkt) translokeerub aktseptor-regiooni genoomi teises otsas. Pöördtranskriptaas töötleb seda ala hiljem tänu oma DNA-sõltuvale DNA aktiivsusele.[7] Retroviraalse RNA praimeri seondumise ala PBS regiooni 5' otsas asub U5 ning sellest 3' otsas paikneb "juhtiv" ala. tRNA praimer on 14. ja 22. nukleotiidi vahel lahti harutatud ning moodustab viraalse RNA PBS regiooni aluspaaridega dupleksi. PBS paiknemine viraalse RNA 5’-otsa lähedal on ebatavaline, kuna pöördtranskriptaas sünteesib DNA-d praimeri 3’-otsast 5’-3’-suunas (vaadeldes RNA matriitsi). Seega praimer ja pöördtranksriptaas peavad ümber paiknema viraalse RNA 3’-otsa. Nende ümberpaigutumine hõlmab mitut etappi ja kasutab mitmeid ensüüme, sealhulgas DNA polümeraas, ribonukleaas H (RNaas H) ja vajalik on polünukleotiidide lahti keerdumine.[8][9]

HI-viiruse pöördtranskriptaas omab samuti ribonukleaasset aktiivsust, mis lagundab cDNA sünteesi käigus viraalse RNA. Lisaks on HIV pöördtranskriptaasil DNA-sõltuv DNA polümeraasne aktiivsus, mis kopeerib cDNA senssahela antisenss-DNA ahelaks, et sünteesida kaheahelaline viraalse DNA vaheühend vDNA.[10]

Viited

[muuda | muuda lähteteksti]
  1. ↑ Ferris, A. L., Hizi, A.; Showalter, S.D., Pichuantes, S., Babe, L., Craik, C-S., Hughes, S.H. (1990). Immunologic and proteolytic analysis of HIV-1 reverse transcriptase structure. Virology. 175 : 456–64. PMID 1691562.
  2. ↑ Konishi, A., Yasukawa, K., Inouye, K. (2012). Improving the thermal stability of avian myeloblastosis virus reverse transcriptase α-subunit by site-directed mutagenesis. Biotechnol Lett. 34 (7): 1209–15. PMID 22426840.
  3. ↑ Temin, H. M., Mizutani, S. (1970). RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature. 226 (5252): 1211–3. PMID 4316301.
  4. ↑ Baltimore, D. (1970). RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252): 1209–11. PMID 4316300.
  5. ↑ (1970). Central dogma reversed. Nature. 226 (5252): 1198–9. PMID 5422595.
  6. ↑ 6,0 6,1 "Retrovirus". 17.02.2009. Originaali arhiivikoopia seisuga 28.04.2021.
  7. ↑ 7,0 7,1 Telesnitsky, A., Goff, S. P. (1993). Strong-stop strand transfer during reverse transcription. Reverse transcriptase (1st ed.). New York: Cold Spring Harbor. p 49. ISBN 0-87969-382-7.
  8. ↑ Bernstein, A., Weiss,R., Tooze, J. (1985). RNA tumor viruses. Molecular Biology of Tumor Viruses (2nd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory.
  9. ↑ Moelling, K.; Broecker, F. (2015) The reverse transcriptase–RNase H: from viruses to antiviral defense. Ann N Y Acad Sci. 1341:126–35. PMID 25703292
  10. ↑ Hu, W.-S., Hughes, S. H. (2012). HIV-1 Reverse Transcription. Cold Spring Harb Perspect Med. 2(10). PMID 23028129