Evolución dirixida

Un exemplo de evolución dirixida comparada coa evolución natural. O ciclo interno indica as tres etapas do ciclo de evolución dirixida co proceso natural imitado entre corchetes. O círculo externo mostra os pasos dun experimento típico. Os símbolos vermellos indican variantes funcionais, os símbolos pálidos indican variantes coa función reducida.

A evolución dirixida ou ED (DE, en inglés) é un método utilizado en enxeñaría de proteínas que imita o proceso de selección natural para facer evolucionar as proteínas ou ácidos nucleicos cara a un obxectivo definido polo usuario.^[1] Consiste en someter a un xene a repetidas roldas de mutaxénese (creando unha libraría de variantes), de selección (expresando as variantes e illando os membros coa función deexada), e de amplificación (xerando un molde para a seguinte rolda). Pode realizarse in vivo (en células), ou in vitro (libre en solución ou microgota). A evolución dirixida utilízase na enxeñaría de proteínas como unha alternativa ás proteínas modificadas por deseño racional, e tamén en estudos de principios fundamentais da evolución nun ambiente de laboratorio controlado.

Principios

A evolución dirixida é algo análogo a subir un monte nunha 'paisaxe de fitness', onde a elevación representa a propiedade desexada. Cada rolda de selección mostrea mutantes en todos os lados do molde de inicio (1) e selecciona o mutante coa maior elevación, e así sóbese o monte. Isto repítese ata que se chegue a un cumio local (2).

A evolución dirixida é unha imitación feita no laboratorio do ciclo da evolución natural. Para que se produza a evolución cómpren tres cousas: que haxa variacións entre os replicadores, que a variación cause deferenzas de fitness sobre as cales actúe a selección natural, e que estas variacións sexan herdables. En ED, un só xene faise evolucionar por reiteradas roldas de mutaxénese, selección ou screening, e amplificación.^[2] As roldas destes pasos repítense usando a mellor variante dunha rolda como molde para a seguinte para conseguir melloras paso a paso.

A probabilidade de éxito nun experimento de evolución dirixida está directamente relacionada co tamaño total da libraría, xa que avaliar máis mutantes incrementa as probabilidades de atopar unha coas propiedades desexadas.^[3]

Xeración de variacións

Xene inicial (esquerda) e libraría de variantes (dereita). As mutacións puntuais cambian un só nucleótido. As nsercións e delecións engaden ou eliminan seccións do ADN. Recombínanse (intercámbianse) segmentos de dous ou máis senes similares.

O primeiro paso para realizar un ciclo de evolución dirixida é a xeración dunha libraría de xenes variantes. O espazo de secuencia para a secuencia aleatoria é grande (10¹³⁰ posibles secuencias para unha proteína de 100 aminoácidos) e poboado de forma extremadamente dispersa por proteínas funcionais. Nin a evolución experimental,^[4] nin a natural^[5] poden nin sequera aproximarse a unha mostraxe con tantas secuencias. Por suposto, a evolución natural mostrea secuencias variantes preto das secuencias de proteínas funcionais e isto é imitado en ED ao someter a mutaxénese a un xene xa funcional. Algúns cálculos suxiren que é perfectamente factible que para todos os propósitos prácticos (é dicir, funcional e estrutural), o espazo de secuencia da proteína fose completamente explorado durante o curso da evolución da vida na Terra.^[6]

O xene inicial pode ser sometido a mutaxénese por mutacións puntuais aleatorias (por mutaxénese química ou PCR proclive ao erro)^[7][8] e insercións e delecións (por transposóns).^[9] A recombinación de xenes pode ser imitada polo intercambio do ADN^[10][11] de varias secuencias (normalmente con máis dun 70% de homoloxía) para saltar a rexións do espazo de secuencia entre os xenes parentais intercambiados. Finalmente, rexións específicas dun xene poden ser sistematicamente aleatorizadas^[12] para unha estratexia máis centrada baseada no coñecemento da estrutura e función. Dependendo do método, a libraría xerada variará na proporción de variantes funcionais que contén. Mesmo se se utiliza un organismo para expresar o xene de interese, sometendo a mutaxénese só ese xene, o resto do xenoma do organismo permanece igual e pode ser ignorado para o experimento evolutivo (para proporcionar un ambiente xenético constante).

Detección de diferenzas de fitness

A maioría das mutacións son deletéreas polo que as librarías de mutantes adoitan ter maiormente variantes con reducida actividade.^[13] Por tanto, un ensaio de alto rendemento é vital para medir a actividade para encontrar as raras variantes con mutacións beneficiosas que melloran as propiedades desexadas. Hai dous tipos de métodos para illar variantes funcionais. Os sistemas de selección acoplan directamente a función da proteína coa supervivencia do xene, mentres que os sistemas de screening proban individualmente cada variante e permiten establecer un limiar cuantitativo para escoller unha variante ou poboación de variantes dunha actividade desexada. Tanto a selección coma o screening poden realizarse en células vivas (evolución in vivo) ou realizarse directamente na proteína ou ARN fóra de células (evolución in vitro).^[14][15]

Durante a evolución in vivo, cada célula (xeralmente bacterias ou levedos) é transformada cun plásmido que contén un membro diferente da libraría variante. Deste modo, as células diferenciaranse só no xene de interese, e todos os outros xenes seguen sendo os mesmos. As células expresan a proteína no citoplasma ou na súa surperficie, onde a súa función pode ser comprobada. Este formato ten a vantaxe de seleccionar as propiedades nun ambiente celular, o cal é útil cando a proteína ou ARN feitos evolucionar teñen que utilizarse en organismos vivos. Cando se realiza sen células, a ED implica o uso de transcrición tradución in vitro para producir proteínas ou ARN libre en solución ou comparimentalizado en microgotas artificiais. Este método ten a vantaxe de ser máis versátil nas condicións de selección (por exemplo, temperatura, solvente), e pode expresar proteínas que serían tóxicas para as células. Ademais, os experimentos de evolución in vitro poden xerar librarías moito máis grandes (de ata 10¹⁵) porque a libraría de ADN non necesita ser inserida en células (o que adoita ser un paso limitante).

Selección

A selección de actividade de unión é conceptualmente simple. A molécula diana é mobilizada nun soporte sólido, vértese sobre el unha libraría de proteínas variantes, as moléculas que unan mal son eliminadas por lavado, e as restantes variantes unidas son recuperadas para illar os seus xenes.^[16] Utilizouse tamén a unión dun encima a un inhibidor covalente inmobilizado para illar catalizadores activos. Porén, esta estratexia só selecciona un só recambio catalítico e non é un bo modelo de unión a substrato ou da verdadeira reactividade do susbtrato. Se a actividade dun encima se fai necesaria para a superivencia dunha célula, por exemplo para sintetizar un metabolito vital ou para destruír unha toxina, entón a supervivencia da célula é función da actividade encimática.^[17][18] Tales sistemas xeralmente só están limitados en rendemento pola eficacia na transformación das células. Son tamén máis baratos e menos traballosos que o screening, aínda que son normalmente difíciles para facer a enxeñaría, proclives a artefactos e non dan información sobre o rango de actividades presente na libraría.

Screening

Unha alternativa á selección é un sistema de cribado. Cada xene variante é expresado individualmente e probado para medir cuantitativamente a actividade (xeralmente por medio dun produto colorixénico ou fluorixénico). As variantes son despois ordenadas e o experimentador decide que variantes vai usar como moldes para a seguinte rolda de ED. Mesmo os ensaios de maior alto rendemento adoitan ter menor cobertura que os métodos de selección pero teñen a vantaxe de producir información detallada sobre cada unha das variantes sometidas ao screening. Estes datos desagregados poden usarse tamén para caracterizar a distribución de actividades en librarías, o cal non é posible en sistemas de selección simples. Os sistemas de screening, por tanto, teñen vantaxes cando chegan a caracterizar experimentalmente a evolución adaptativa e as paisaxes de fitness.

Asegurar a herdanza

Unha proteína expresada pode estar unida covalentemente ao seu xene (como no ARNm, á esquerda) ou compartmentalizada en (céulas ou compartimentos artificiais, á dereita). Ambas as maneiras aseguran que se pode illar o xene baseándose na actividde da proteína codificada.

Cando se illan proteínas funcionais, é necesario illar tamén os seus xenes, polo que cómpre que haxa unha ligazón xenotipo-fenotipo.^[17] Esta pode ser covalente, como no mRNA display no que o xene do ARNm está ligado á proteína ao final da tradución por puromicina.^[19] Alternativamente a proteína e o seu xene poden ser colocalizados por compartimentalización en células vivas^[20] ou por gotas de emulsión.^[21] As secuencias de xenes illadas son despois amplificadas por PCR ou por bacterias hóspedes transformadas. Como moldes para a seguinte rolda de mutaxénese pode utilizarse tanto unha secuencia mellor única coma unha poza de secuencias. Os ciclos repetidos de Diversificación-Selección-Amplificación xeran variantes de proteínas adaptadas ás presións de selección aplicadas.

Comparación co deseño racional de proteínas

Vantaxes da evolución dirixida

O deseño racional dunha proteína depende do coñecemento en profundidade da estrutura das proteínas, e o seu mecanismo catalítico.^[22][23] Os cambios específicos fanse por mutaxénese dirixida a sitio para intentrar cambiar a función da proteína. Un inconveniente disto é que mesmo cando a estrutura e o mecanismo de acción da proteína se coñecen ben, o cambio debido á mutación é aínda difícil de predicir. Por tanto, unha vantaxe da ED é que non é preciso comprender o mecanismo da actividade desexada ou como lle afectarán as mutacións.^[24]

Limitacións da evolución dirixida

Unha restrición que ten a evolución dirixida é que é necesario un ensaio de alto rendemento para medir os efectos dun gran número de mutacións aleatorias diferentes. Para isto pode ser necesaria unha extensa investigación e desenvolvemento antes de que se poida usar para a evolución dirixida. Ademais, ditos ensaios adoitan ser moi específicos para monitorizar unha actividade particular e así non son transferibles a novos experimentos de ED.^[25]

Adicionalmente, seleccionar unha mellora na función ensaiada simplemente xera melloras na función ensaiada. Para comprender como se conseguen esas melloras, hai que medir as propiedades dos encimas que evolucionan. A mellora da actividade ensaiada pode deberse a melloras na actividade catalítica do encima ou á concentración de encima. Ademais non hai garantía de que a mellora sobre un substrato mellorará a actividade sobre outro. Isto é particularmente importantes cando a actividade desexada non pode ser sometida a screening directamente ou seleccionada, así que se usa un substrato ‘proxy’. A ED pode levar a unha especialización evolutiva ao proxy sen mellorar a actividade desexada. En consecuencia, elixir un apropiado screening ou as condicións de selección é esencial para o éxito da ED.

Estratexias combinatorias

As estratexias 'semi-racionais' combinadas están a investigarse para superar as limitacións que teñen tanto o deseño racional coma a evolución dirixida.^[26][27] As mutacións beneficiosas son raras, polo que teñen que ser sometidos a sreeening unha gran cantidade de mutantes aleatorios para encontrar variantes melloradas. As 'librarías enfocadas' (focussed libraries) concéntranse en rexións aleatorizantes que se cre que son máis ricas en mutacións beneficiosas en mutacións artificiais para a fase de mutaxénese da ED. Unha libraría enfocada contén menos variantes que unha libraría de mutaxénese tradicional e así non require dito screening de alto rendemento.

Crear unha libraría enfocada require ter certos coñecementos de que residuos da estrutura hai que mutar. Por exemplo, ter coñecementos sobre o centro activo dun encima pode permitir saber os residuos que interaccionan co substrato para que sexan aleatorizados.^[28][29] Alternativamente, o coñecemento de que rexións das proteínas son variables por natureza pode guiar a mutaxénese a esas rexións.^[30][31]

Usos

A evolución dirixida é usada frecuentemente na enxeñaría de proteínas como unha alternativa ao deseño racional,^[32] pero pode tamén utilizarse para investigar cuestións fundamentais sobre a evolución dos encimas.^[33]

Enxeñaría de proteínas

Como ferramenta para a enxeñaría de proteínas, a ED tivo máis éxito en tres áreas:

1. Mellorar a estabilidade das proteínas para usos biotecnolóxicos a altas temperaturas en solventes fortes.^[34][35]
2. Mellorar a afinidade de unión dos anticorpos terapéuticos (maduración da afinidade)^[36] e a actividade de novo de encimas deseñados.^[24]
3. Alterar a especificidade de substrato de encimas existentes,^{[37][38][39][40]} (xeralmente para o seu uso en industria).^[32]

Estudos de evolución

O estudo da evolución natural está tradicionalmente baseado en organismos existentes e os seus xenes. Porén, a investigación está fundamentalmente limitada pola falta de fósiles (e particularmente a falta de secuencias de ADN antigo)^[41][42] e o coñecemento incompleto das antigas condicións ambientais. A evolución dirixida investiga a evolución nun sistema controlado de xenes para encimas concretos,^[27][43][44] ribozimas^[45] e replicadores^[46][47] (similar á evolución experimental de eucariotas,^[48][49] procariotas^[50] e virus^[51]).

A ED permite controlar a presión de selección, a taxa de mutación e o ambiente (tanto o ambiente abiótico como a temperatura, coma o ambiente ambiente biótico, como o outros xenes do organismo). Adicionalmente, hai un rexistro completo de todos os xenes intermediarios evolutivos. Isto permite facer medidas detalladas dos procesos evolutivos, por exemplo a epistase, evolucionabilidade, restricións adaptativas^[52][53] paisaxes de fitness,^[54] e redes neutrais.^[55]

Notas

1. Stephen Lutz, Beyond directed evolution - semi-rational protein engineering and design, Curr Opin Biotechnol. 2010 December ; 21(6): 734–743.
2. Voigt, CA; Kauffman, S; Wang, ZG (2000). "Rational evolutionary design: the theory of in vitro protein evolution.". Advances in protein chemistry 55: 79–160. PMID 11050933. doi:10.1016/s0065-3233(01)55003-2. 
3. Dalby, PA (August 2011). "Strategy and success for the directed evolution of enzymes.". Current Opinion in Structural Biology 21 (4): 473–80. PMID 21684150. doi:10.1016/j.sbi.2011.05.003. 
4. Lipovsek, D; Plückthun, A (July 2004). "In-vitro protein evolution by ribosome display and mRNA display.". Journal of immunological methods 290 (1-2): 51–67. PMID 15261571. doi:10.1016/j.jim.2004.04.008. 
5. Dryden, DT; Thomson, AR; White, JH (6 August 2008). "How much of protein sequence space has been explored by life on Earth?". Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society 5 (25): 953–6. PMID 18426772. doi:10.1098/rsif.2008.0085. 
6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2459213/
7. Kuchner, O; Arnold, FH (December 1997). "Directed evolution of enzyme catalysts.". Trends in Biotechnology 15 (12): 523–30. PMID 9418307. doi:10.1016/s0167-7799(97)01138-4. 
8. Sen, S; Venkata Dasu, V; Mandal, B (December 2007). "Developments in directed evolution for improving enzyme functions.". Applied biochemistry and biotechnology 143 (3): 212–23. PMID 18057449. doi:10.1007/s12010-007-8003-4. 
9. Jones, DD (16 May 2005). "Triplet nucleotide removal at random positions in a target gene: the tolerance of TEM-1 beta-lactamase to an amino acid deletion.". Nucleic Acids Research 33 (9): e80. PMID 15897323. doi:10.1093/nar/gni077. 
10. Stemmer, WP (4 August 1994). "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling.". Nature 370 (6488): 389–91. PMID 8047147. doi:10.1038/370389a0. 
11. Crameri, A; Raillard, SA; Bermudez, E; Stemmer, WP (15 January 1998). "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution.". Nature 391 (6664): 288–91. PMID 9440693. doi:10.1038/34663. 
12. Reetz, MT; Carballeira, JD (2007). "Iterative saturation mutagenesis (ISM) for rapid directed evolution of functional enzymes.". Nature protocols 2 (4): 891–903. PMID 17446890. doi:10.1038/nprot.2007.72. 
13. Hartl, DL (October 2014). "What can we learn from fitness landscapes?". Current opinion in microbiology 21C: 51–57. PMID 25444121. doi:10.1016/j.mib.2014.08.001. 
14. Badran, AH; Liu, DR (7 November 2014). "In vivo continuous directed evolution.". Current Opinion in Chemical Biology 24C: 1–10. PMID 25461718. doi:10.1016/j.cbpa.2014.09.040. 
15. Kumar, A; Singh, S (December 2013). "Directed evolution: tailoring biocatalysts for industrial applications.". Critical reviews in biotechnology 33 (4): 365–78. PMID 22985113. doi:10.3109/07388551.2012.716810. 
16. Willats, WG (December 2002). "Phage display: practicalities and prospects.". Plant molecular biology 50 (6): 837–54. PMID 12516857. 
17. Leemhuis, H; Stein, V; Griffiths, AD; Hollfelder, F (August 2005). "New genotype-phenotype linkages for directed evolution of functional proteins.". Current Opinion in Structural Biology 15 (4): 472–8. PMID 16043338. doi:10.1016/j.sbi.2005.07.006. 
18. Verhoeven, KD; Altstadt, OC; Savinov, SN (March 2012). "Intracellular detection and evolution of site-specific proteases using a genetic selection system.". Applied biochemistry and biotechnology 166 (5): 1340–54. PMID 22270548. doi:10.1007/s12010-011-9522-6. 
19. Lipovsek, D; Plückthun, A (July 2004). "In-vitro protein evolution by ribosome display and mRNA display.". Journal of immunological methods 290 (1-2): 51–67. PMID 15261571. doi:10.1016/j.jim.2004.04.008. 
20. Nguyen, AW; Daugherty, PS (March 2005). "Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.". Nature Biotechnology 23 (3): 355–60. PMID 15696158. doi:10.1038/nbt1066. 
21. Schaerli, Y; Hollfelder, F (December 2009). "The potential of microfluidic water-in-oil droplets in experimental biology.". Molecular bioSystems 5 (12): 1392–404. PMID 20023716. doi:10.1039/b907578j. 
22. Marshall, SA; Lazar, GA; Chirino, AJ; Desjarlais, JR (1 March 2003). "Rational design and engineering of therapeutic proteins.". Drug Discovery Today 8 (5): 212–21. PMID 12634013. doi:10.1016/s1359-6446(03)02610-2. 
23. Wilson, CJ (27 October 2014). "Rational protein design: developing next-generation biological therapeutics and nanobiotechnological tools.". Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology. PMID 25348497. doi:10.1002/wnan.1310. 
24. Giger, L; Caner, S; Obexer, R; Kast, P; Baker, D; Ban, N; Hilvert, D (August 2013). "Evolution of a designed retro-aldolase leads to complete active site remodeling.". Nature Chemical Biology 9 (8): 494–8. PMID 23748672. doi:10.1038/nchembio.1276. 
25. Bornscheuer, UT; Pohl, M (April 2001). "Improved biocatalysts by directed evolution and rational protein design.". Current Opinion in Chemical Biology 5 (2): 137–43. PMID 11282339. doi:10.1016/s1367-5931(00)00182-4. 
26. Lutz, S (December 2010). "Beyond directed evolution--semi-rational protein engineering and design.". Current opinion in biotechnology 21 (6): 734–43. PMID 20869867. doi:10.1016/j.copbio.2010.08.011. 
27. Goldsmith, M; Tawfik, DS (August 2012). "Directed enzyme evolution: beyond the low-hanging fruit.". Current Opinion in Structural Biology 22 (4): 406–12. PMID 22579412. doi:10.1016/j.sbi.2012.03.010. 
28. Chen, MM; Snow, CD; Vizcarra, CL; Mayo, SL; Arnold, FH (April 2012). "Comparison of random mutagenesis and semi-rational designed libraries for improved cytochrome P450 BM3-catalyzed hydroxylation of small alkanes.". Protein engineering, design & selection : PEDS 25 (4): 171–8. PMID 22334757. doi:10.1093/protein/gzs004. 
29. Acevedo-Rocha, CG; Hoebenreich, S; Reetz, MT (2014). "Iterative saturation mutagenesis: a powerful approach to engineer proteins by systematically simulating Darwinian evolution.". Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 1179: 103–28. PMID 25055773. doi:10.1007/978-1-4939-1053-3_7. 
30. Jochens, H; Bornscheuer, UT (3 September 2010). "Natural diversity to guide focused directed evolution.". Chembiochem : a European journal of chemical biology 11 (13): 1861–6. PMID 20680978. doi:10.1002/cbic.201000284. 
31. Jochens, H; Aerts, D; Bornscheuer, UT (December 2010). "Thermostabilization of an esterase by alignment-guided focussed directed evolution.". Protein engineering, design & selection : PEDS 23 (12): 903–9. PMID 20947674. doi:10.1093/protein/gzq071. 
32. Turner, NJ (August 2009). "Directed evolution drives the next generation of biocatalysts.". Nature Chemical Biology 5 (8): 567–73. PMID 19620998. doi:10.1038/nchembio.203. 
33. Romero, PA; Arnold, FH (December 2009). "Exploring protein fitness landscapes by directed evolution.". Nature reviews. Molecular cell biology 10 (12): 866–76. PMC 2997618. PMID 19935669. doi:10.1038/nrm2805. 
34. Gatti-Lafranconi, P; Natalello, A; Rehm, S; Doglia, SM; Pleiss, J; Lotti, M (8 January 2010). "Evolution of stability in a cold-active enzyme elicits specificity relaxation and highlights substrate-related effects on temperature adaptation.". Journal of Molecular Biology 395 (1): 155–66. PMID 19850050. doi:10.1016/j.jmb.2009.10.026. 
35. Zhao, H; Arnold, FH (January 1999). "Directed evolution converts subtilisin E into a functional equivalent of thermitase.". Protein engineering 12 (1): 47–53. PMID 10065710. doi:10.1093/protein/12.1.47. 
36. Hawkins, RE; Russell, SJ; Winter, G (5 August 1992). "Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation.". Journal of Molecular Biology 226 (3): 889–96. PMID 1507232. doi:10.1016/0022-2836(92)90639-2. 
37. Shaikh, FA; Withers, SG (April 2008). "Teaching old enzymes new tricks: engineering and evolution of glycosidases and glycosyl transferases for improved glycoside synthesis.". Biochemistry and cell biology = Biochimie et biologie cellulaire 86 (2): 169–77. PMID 18443630. doi:10.1139/o07-149. 
38. Cheriyan, M; Walters, MJ; Kang, BD; Anzaldi, LL; Toone, EJ; Fierke, CA (1 November 2011). "Directed evolution of a pyruvate aldolase to recognize a long chain acyl substrate.". Bioorganic & Medicinal Chemistry 19 (21): 6447–53. PMID 21944547. doi:10.1016/j.bmc.2011.08.056. 
39. MacBeath, G; Kast, P; Hilvert, D (20 March 1998). "Redesigning enzyme topology by directed evolution.". Science 279 (5358): 1958–61. PMID 9506949. doi:10.1126/science.279.5358.1958. 
40. Toscano, MD; Woycechowsky, KJ; Hilvert, D (2007). "Minimalist active-site redesign: teaching old enzymes new tricks.". Angewandte Chemie International Edition in English 46 (18): 3212–36. PMID 17450624. doi:10.1002/anie.200604205. 
41. Pääbo, S; Poinar, H; Serre, D; Jaenicke-Despres, V; Hebler, J; Rohland, N; Kuch, M; Krause, J; Vigilant, L; Hofreiter, M (2004). "Genetic analyses from ancient DNA.". Annual Review of Genetics 38 (1): 645–79. PMID 15568989. doi:10.1146/annurev.genet.37.110801.143214. 
42. Höss, M; Jaruga, P; Zastawny, TH; Dizdaroglu, M; Pääbo, S (1 April 1996). "DNA damage and DNA sequence retrieval from ancient tissues.". Nucleic Acids Research 24 (7): 1304–7. PMID 8614634. doi:10.1093/nar/24.7.1304. 
43. Bloom, JD; Arnold, FH (16 June 2009). "In the light of directed evolution: pathways of adaptive protein evolution.". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 Suppl 1 (Supplement_1): 9995–10000. PMID 19528653. doi:10.1073/pnas.0901522106. 
44. Moses, AM; Davidson, AR (17 May 2011). "In vitro evolution goes deep.". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 (20): 8071–2. PMID 21551096. doi:10.1073/pnas.1104843108. 
45. Salehi-Ashtiani, K; Szostak, JW (1 November 2001). "In vitro evolution suggests multiple origins for the hammerhead ribozyme.". Nature 414 (6859): 82–4. PMID 11689947. doi:10.1038/35102081. 
46. Sumper, M; Luce, R (January 1975). "Evidence for de novo production of self-replicating and environmentally adapted RNA structures by bacteriophage Qbeta replicase.". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 72 (1): 162–6. PMC 432262. PMID 1054493. doi:10.1073/pnas.72.1.162. 
47. Mills, DR; Peterson, RL; Spiegelman, S (July 1967). "An extracellular Darwinian experiment with a self-duplicating nucleic acid molecule.". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 58 (1): 217–24. PMC 335620. PMID 5231602. doi:10.1073/pnas.58.1.217. 
48. Marden, JH; Wolf, MR; Weber, KE (November 1997). "Aerial performance of Drosophila melanogaster from populations selected for upwind flight ability.". The Journal of Experimental Biology 200 (Pt 21): 2747–55. PMID 9418031. 
49. Ratcliff, WC; Denison, RF; Borrello, M; Travisano, M (31 January 2012). "Experimental evolution of multicellularity.". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109 (5): 1595–600. PMID 22307617. doi:10.1073/pnas.1115323109. 
50. Barrick, JE; Yu, DS; Yoon, SH; Jeong, H; Oh, TK; Schneider, D; Lenski, RE; Kim, JF (29 October 2009). "Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.". Nature 461 (7268): 1243–7. PMID 19838166. doi:10.1038/nature08480. 
51. Heineman, RH; Molineux, IJ; Bull, JJ (August 2005). "Evolutionary robustness of an optimal phenotype: re-evolution of lysis in a bacteriophage deleted for its lysin gene.". Journal of Molecular Evolution 61 (2): 181–91. PMID 16096681. doi:10.1007/s00239-004-0304-4. 
52. Steinberg, Barrett; Ostermeier, Marc (2016-01-01). "Environmental changes bridge evolutionary valleys". Science Advances (en inglés) 2 (1): e1500921. ISSN 2375-2548. PMC 4737206. PMID 26844293. doi:10.1126/sciadv.1500921. 
53. Arnold, FH; Wintrode, PL; Miyazaki, K; Gershenson, A (February 2001). "How enzymes adapt: lessons from directed evolution.". Trends in Biochemical Sciences 26 (2): 100–6. PMID 11166567. doi:10.1016/s0968-0004(00)01755-2. 
54. Aita, T; Hamamatsu, N; Nomiya, Y; Uchiyama, H; Shibanaka, Y; Husimi, Y (5 July 2002). "Surveying a local fitness landscape of a protein with epistatic sites for the study of directed evolution.". Biopolymers 64 (2): 95–105. PMID 11979520. doi:10.1002/bip.10126.abs. 
55. Bloom, JD; Raval, A; Wilke, CO (January 2007). "Thermodynamics of neutral protein evolution.". Genetics 175 (1): 255–66. PMID 17110496. doi:10.1534/genetics.106.061754. 

Véxase tamén

• Aplicacións:
  • Enxeñaría de proteínas
  • Enxeñaría de encimas
  • Deseño de proteínas
  • Código xenético expandido:
  • Mutaxénese aleatoria
• Selección e screening:
  • Yeast display
  • Bacterial display
  • Phage display
  • Ribosome display
  • mRNA display

Ligazóns externas

• Grupos de investigación
  • The Dan Tawfik Research Group
  • The Ulrich Schwaneberg Research Group
  • The Frances Arnold Research Group Arquivado 29 de decembro de 2019 en Wayback Machine.
  • The Huimin Zhao Research Group
  • The Manfred Reetz Research Group
  • The Donald Hilvert Group
  • The Darren Hart Research Group
  • The David Liu Research Group
  • The Douglas Clark Research Group
  • The Paul Dalby Research Group
• SeSaM-Biotech - Directed Evolution
• Prof. Reetz explica o principio da evolución dirixida
• Codexis, Inc.