Fi X 174

Escherichia virus ΦX174
Micrografía electrónica do fago ΦX174
Clasificación científica
Grupo: Virus (non clasificado) Realm: Monodnaviria Reino: Sangervirae` Filo: Phixviricota Clase: Malgrandaviricetes Orde: Petitvirales Familia: Microviridae Xénero: Sinsheimervirus Especie: Escherichia virus ΦX174

Estrutura da cápside do fago ΦX174

Debuxo esquemático dun virión de Sins­heimer­virus (tamén chamado Phix174­micro­virus)

O fi X 174 (ou fiX174, ΦX174, phiX174 ou Escherichia coli ΦX174) é un virus bacteriófago con ADN monocatenario (virus de ADN monocatenario) que infecta a bacteria Escherichia coli, e foi o primeiro xenoma de ADN en ser secuenciado. Este traballo foi completado por Fred Sanger e o seu equipo en 1977.^[1] En 1962, Walter Fiers e Robert Sinsheimer xa demostraran que o ADN deste virus era un círculo pechado covalentemente.^[2] O gañador do Premio Nobel Arthur Kornberg usou ΦX174 como modelo para probar que o ADN sintetizado nun tubo de ensaio por encimas purificados podía producir todas as características dun virus natural, dando comezo á idade da bioloxía sintética.^[3][4] En 1972–1974, Jerard Hurwitz, Sue Wickner e Reed Wickner e os seus colaboradores identificaron os xenes necesarios para producir os encimas que catalizan a conversión da forma monocatenaria do virus á súa forma replicativa bicatenaria.^[5] En 2003, o grupo de Craig Venter informou que o xenoma de ΦX174 foi o primeiro en ser completamente ensamblado in vitro a partir de oligonucleótidos sintetizados.^[6] A partícula vírica completa de ΦX174 foi tamén ensamblada con éxito in vitro.^[7] En 2012 demostrouse como o seu xenoma moi solapado pode ser completamente descomprimido e aínda segue sendo funcional.^[8]

Xenoma

Xenoma do bacteriófago ΦX174 mostrando os seus 11 xenes.^[9]

Este bacteriófago ten un xenoma de ADN circular monocatenario con sentido [+] de 5.386 nucleótidos.^[9] O contido GC do xenoma é do 44% e o 95% dos nucleótidos pertencen a xenes codificantes. Debido ao padrón de bases equilibrado do xenoma, utilízase como ADN control para os secuenciadores de Illumina.

Xenes

O ΦX174 codifica 11 xenes, nomeados coas letras consecutivas do alfabeto pola orde en que se descubriron, coa excepción do A*, que é un codón de inicio alternativo dos grandes xenes A. Soamente os xenes A* e K se cre que non son esenciais, aínda que hai algunhas dúbidas sobre A*, porque o seu codón de inicio podería ser cambiado a ATT pero non a ningunha outra secuencia.^[10] Sábese que co ATT probablemente aínda pode producir proteínas^[11] dentro de E. coli e, por tanto, este xene pode ser, de feito, esencial.

A primeira metade do xenoma de ΦX174 presenta altos niveis de solapamento de xenes,^[12] porque 8 dos 11 xenes están solapados en polo menos un nucleótido.^[1] Estes solapamentos está demostrado que non son esenciais,^[8] aínda que o fago refeito con todos os solapamentos de xenes eliminados ten unha menor fitness respecto ao tipo silvestre.^[13]

O fago ΦX174 foi utilizado para tratar de establecer a información xenética non descuberta por unha estratexia de "proba por síntese".^[14]

Transcritoma

En 2020, xerouse o transcritoma de ΦX174.^[15] Características notables deste transcritoma son unha serie de ata catro promotores relativamente débiles en serie con ata catro terminadores (intrínsecos) independentes de Rho e un terminador dependente de Rho.

Proteínas

ΦX174 codifica 11 proteínas.

Proteína	Copias	Función[16]
A	—	Fai unha amosega no ADN da forma replicativa (RF) para iniciar a replicación en círculo rodante; liga extremos do ADN do fago linear para dar lugar ao ADN circular monocatenario
A*	—	Inhibe a replicación do ADN da célula hóspede; bloquea o fago superinfectante; non esencial
B	60 na procápside	Proteína do armazón interno implicada na ensamblaxe da procápside
C	—	Empaquetamento do ADN
D	240 na procápside	Proteína do armazón externo implicada na ensamblaxe da procápside
E	—	Lise da célula hóspede
F	60 no virión	Proteína maior da cápside
G	60 no virión	Proteína maior da espícula
H	12 no virión	Proteína piloto do ADN (ou proteína menor da espícula)
J	60 no virión	Únese a un novo ADN do fago monocatenario; acompaña o ADN do fago na procápside
K	—	Optimiza o "tamaño de explosión" (número medio de fagos liberados por bacteria); non esencial

Proteoma

A identificación de todas as protínas de ΦX174 usando espectrometría de masas publicouse recentemente.^[13]

Ciclo de infección

A infección empeza cando a proteína G do virus se une aos lipopolisacáridos da superficie da célula hóspede bacteriana. A proteína H (ou proteína piloto do ADN) pilota o paso do xenoma viral a través da membrana bacteriana de E. coli^[17] máis probablemente por medio dunha hélice do dominio transmembrana N-terminal predito.^[18] Porén, a proteína H é unha proteína multifuncional.^[19] Esta é a única proteína da cápside viral de ΦX174 que carece de estrutura cristalina por un par de razóns. Ten un contido aromático baixo e un alto contido de glicina, facendo que a estrutura da proteína sexa moi flexible e ademais, os átomos individuais de hidróxeno (o grupo R das glicinas) son difíciles de detectar en cristalografía de proteínas. Ademais, a proteína H induce a lise do hóspede bacteriano a altas concentracións, xa que a hélice transmembrana N-terminal predita fai facilmente buratos na parede bacteriana. Por medio da bioinformática sábese que esta proteína contén catro dominios superenrolados preditos que teñen unha homoloxía significativa con factores de transcrición coñecidos. Adicionalmente, determinouse que a protreína H de novo era necesaria para a síntese óptima doutras proteínas virais.^[20] As mutacións na proteína H impiden a incorporación viral, poden ser superadas cando se proporcionan cantidades en exceso de proteína B, a proteína do armazón interno.

O ADN é exectado a través dunha canle hidrófila.^[21] Sábese que a proteína H reside nesta área pero as evidencias experimentais non verificaron a súa localización exacta. Unha vez dentro da bacteria, empeza a replicación do xenoma de ADN monoctenario [+] ([+]ssDNA) por medio dun intermediario de ADN de sentido negativo ([-]ssDNA). Isto faise a medida que o xenoma do fago se superenrola e a estrutura secundaria formada por ese superenrolamento atrae o complexo proteico primosoma. Esta trasládase unha vez arredor do xenoma e conforme pasa sintetízase un ADN monocatemario [−] a partir do xenoma orixinal positivo. Os xenomas de ADN monocatenario [+] que se empaquetarán nos virus créanse a partir deste por un mecanismo de círculos rodantes. Este é o mecanismo polo cal ao xenoma superenrolado bicatenario se lle fai unha amosega na febra positiva por unha proteína A codificada polo virus, atraendo ademais unha ADN polimerase bacteriana (DNAP) ao sito de corte. A ADN polimerase usa a febra negativa como molde para facer o ADN de sentido positivo. A medida que se traslada arredor do xenoma despraza a febra externa do ADN xa sintetizado, o cal é cuberto inmediatemente por proteínas SSBP. A proteína A corta o xenoma completo cada vez que recoñece a secuencia de orixe.

Como o transcrito do xene da proteína é o máis abundante, a principal proteína da procápside viral é tamén a D. De xeito similar, os transcritos de xenes para as proteínas F, J e G son máis abundantes que para a H, xa que a estequiometría para estas proteínas estruturais é 5:5:5:1. Os primosomas son complexos proteícos que se unen ao encima helicase no molde. Os primosomas proporcionan cebadores de ARN ás febras para a síntese de ADN.

Filoxenia e diversidade

ΦX174 está estreitamente emparentado cos Microviridae, especialmente cos fagos NC (por exemplo, NC1, NC7, NC11, NC16, NC37, NC5, NC41, NC56, NC51, etc.) e máis distantemente emparentado cos fagos similares a G4 e aínda máis distantemente cos fagos similares a α3. Rokyta et al. 2006 presentaron unha árbore filoxenética das súas relacións.^[22]

Usos

Evolución experimental

ΦX174 utilizouse como organismo modelo en moitos experimentos de evolución.^[23]

Biotecnoloxía

ΦX174 é usado regularmente como un control positivo na secuenciación do ADN debido ao seu tamaño de xenoma relativamente pequeno en comparación con outros organismos e ao seu contido de nucleótidos relativamente equilibrado de aproximadamente 23% G, 22% C, 24% A e 31% T, é dicir, 45% G+C e 55% A+T, ver o acceso NC_001422.1^[9] para a súa secuencia de 5.386 nucleótidos. Os instrumentos de secuenciación da compañía Illumina usan ΦX174 como control positivo,^[24] e unha soa operación (run) de secuenciación de Illumina pode cubrir o xenoma de ΦX174 varios millóns de veces, facendo que moi probablemente sexa un dos xenoma máis intensamente secuenciado da historia.

ΦX174 tamén se usa para comprobar a resistencia dos equipos de protección individual (EPI) a virus que se contaxian polo sangue.^[25]

ΦX174 tamén foi modificado para permitir a exposición de péptidos (phage display) na proteína G da cápside viral.^[26]

Bioloxía sintética

O xenoma de ΦX174 foi o primeiro fago que foi clonado en lévedos,^[8] que proporciona un conveniente dique seco no que experimentar con modificacións do xenoma.^[27] Foi tamén o primeiro xenoma que se descomprimiu totalmente, eliminando todos os seus solapamentos de xenes.^[12] O efecto destes cambios tivo como resultado unha redución significativa da unión ao hóspede, a desregulación da expresión proteica e sensibilidade á calor.^[13]

Notas

1. Sanger F, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Coulson AR, Fiddes CA, et al. (febreiro de 1977). "Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA". Nature 265 (5596): 687–95. Bibcode:1977Natur.265..687S. PMID 870828. doi:10.1038/265687a0. 
2. Fiers W, Sinsheimer RL (outubro de 1962). "The structure of the DNA of bacteriophage phi-X174. III. Ultracentrifugal evidence for a ring structure". Journal of Molecular Biology 5 (4): 424–34. PMID 13945085. doi:10.1016/S0022-2836(62)80031-X. 
3. National Library of Medicine Profiles in Science. The Arthur Kornberg Papers. "Creating Life in the Test Tube," 1959-1970. link
4. Goulian M, Kornberg A, Sinsheimer RL (decembro de 1967). "Enzymatic synthesis of DNA, XXIV. Synthesis of infectious phage phi-X174 DNA". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 58 (6): 2321–8. Bibcode:1967PNAS...58.2321G. JSTOR 58720. PMC 223838. PMID 4873588. doi:10.1073/pnas.58.6.2321. 
5. Wickner S, Hurwitz J (outubro de 1974). "Conversion of phiX174 viral DNA to double-stranded form by purified Escherichia coli proteins". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 71 (10): 4120–4. PMC 434340. PMID 4610569. doi:10.1073/pnas.71.10.4120. 
6. Smith HO, Hutchison CA, Pfannkoch C, Venter JC (decembro de 2003). "Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100 (26): 15440–5. Bibcode:2003PNAS..10015440S. JSTOR 3149024. PMC 307586. PMID 14657399. doi:10.1073/pnas.2237126100. 
7. Cherwa JE, Organtini LJ, Ashley RE, Hafenstein SL, Fane BA (setembro de 2011). "In VITRO ASSEMBLY of the øX174 procapsid from external scaffolding protein oligomers and early pentameric assembly intermediates". Journal of Molecular Biology 412 (3): 387–96. PMID 21840317. doi:10.1016/j.jmb.2011.07.070. 
8. Jaschke PR, Lieberman EK, Rodriguez J, Sierra A, Endy D (decembro de 2012). "A fully decompressed synthetic bacteriophage øX174 genome assembled and archived in yeast". Virology 434 (2): 278–84. PMID 23079106. doi:10.1016/j.virol.2012.09.020. 
9. Enterobacteria phage phiX174 sensu lato, complete genome. "Complete genome: accession NC_001422", National Center for Biotechnology Information. Consultado o 30 de xaneiro de 2016.
10. Baas PD, Liewerink H, van Teeffelen HA, van Mansfeld AD, van Boom JH, Jansz HS (xuño de 1987). "Alteration of the ATG start codon of the A protein of bacteriophage phi X174 into an ATT codon yields a viable phage indicating that A protein is not essential for phi X174 reproduction". FEBS Letters 218 (1): 119–25. PMID 2954853. doi:10.1016/0014-5793(87)81030-x. 
11. Hecht A, Glasgow J, Jaschke PR, Bawazer LA, Munson MS, Cochran JR, et al. (abril de 2017). "Measurements of translation initiation from all 64 codons in E. coli". Nucleic Acids Research 45 (7): 3615–3626. PMC 5397182. PMID 28334756. doi:10.1093/nar/gkx070. 
12. Wright, Bradley W.; Molloy, Mark P.; Jaschke, Paul R. (2021-10-05). "Overlapping genes in natural and engineered genomes". Nature Reviews Genetics (en inglés): 1–15. ISSN 1471-0064. PMC 8490965. PMID 34611352. doi:10.1038/s41576-021-00417-w. 
13. Wright BW, Ruan J, Molloy MP, Jaschke PR (novembro de 2020). "Genome Modularization Reveals Overlapped Gene Topology Is Necessary for Efficient Viral Reproduction". ACS Synthetic Biology 9 (11): 3079–3090. PMID 33044064. doi:10.1021/acssynbio.0c00323. 
14. Jaschke PR, Dotson GA, Hung KS, Liu D, Endy D (novembro de 2019). "Definitive demonstration by synthesis of genome annotation completeness". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 116 (48): 24206–24213. PMC 6883844. PMID 31719208. doi:10.1073/pnas.1905990116. 
15. Logel DY, Jaschke PR (agosto de 2020). "A high-resolution map of bacteriophage ϕX174 transcription". Virology 547: 47–56. PMID 32560904. doi:10.1016/j.virol.2020.05.008. 
16. Fane, Bentley A.; Brentlinger, Karie L.; Burch, April D.; Chen, Min; Hafenstein, Susan; Moore, Erica; Novak, Christopher R.; Uchiyama, Asako (2006). "ɸX174 et al., the Microviridae". En Calender, Richard. The Bacteriophages (2nd ed.). New York: Oxford Univ. Press. p. 130. ISBN 978-0195148503. 
17. Jazwinski SM, Lindberg AA, Kornberg A (xullo de 1975). "The lipopolysaccharide receptor for bacteriophage phiX174 and S13". Virology 66 (1): 268–82. PMID 1094681. doi:10.1016/0042-6822(75)90197-x. 
18. Tusnády GE, Simon I (setembro de 2001). "The HMMTOP transmembrane topology prediction server". Bioinformatics 17 (9): 849–50. PMID 11590105. doi:10.1093/bioinformatics/17.9.849. 
19. Cherwa JE, Young LN, Fane BA (marzo de 2011). "Uncoupling the functions of a multifunctional protein: the isolation of a DNA pilot protein mutant that affects particle morphogenesis". Virology 411 (1): 9–14. PMID 21227478. doi:10.1016/j.virol.2010.12.026. 
20. Ruboyianes MV, Chen M, Dubrava MS, Cherwa JE, Fane BA (outubro de 2009). "The expression of N-terminal deletion DNA pilot proteins inhibits the early stages of phiX174 replication". Journal of Virology 83 (19): 9952–6. PMC 2748053. PMID 19640994. doi:10.1128/JVI.01077-09. 
21. McKenna R, Xia D, Willingmann P, Ilag LL, Krishnaswamy S, Rossmann MG, et al. (xaneiro de 1992). "Atomic structure of single-stranded DNA bacteriophage phi X174 and its functional implications". Nature 355 (6356): 137–43. Bibcode:1992Natur.355..137M. PMC 4167681. PMID 1370343. doi:10.1038/355137a0. 
22. Rokyta DR, Burch CL, Caudle SB, Wichman HA (febreiro de 2006). "Horizontal gene transfer and the evolution of microvirid coliphage genomes". Journal of Bacteriology 188 (3): 1134–42. PMC 1347346. PMID 16428417. doi:10.1128/JB.188.3.1134-1142.2006. 
23. Wichman HA, Brown CJ (agosto de 2010). "Experimental evolution of viruses: Microviridae as a model system". Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences 365 (1552): 2495–501. PMC 2935103. PMID 20643739. doi:10.1098/rstb.2010.0053. 
24. "Using a PhiX Control for HiSeq® Sequencing Runs". Illumina. Arquivado dende o orixinal o 9 de xaneiro de 2019. Consultado o 8 xaneiro de 2019. 
25. "PPE-Info – Standard Details". wwwn.cdc.gov. Arquivado dende o orixinal o 03 de outubro de 2020. Consultado o 2019-02-08. 
26. Christakos KJ, Chapman JA, Fane BA, Campos SK (xneiro de 2016). "PhiXing-it, displaying foreign peptides on bacteriophage ΦX174". Virology 488: 242–8. PMC 6191337. PMID 26655242. doi:10.1016/j.virol.2015.11.021. 
27. Ando H, Lemire S, Pires DP, Lu TK (setembro de 2015). "Engineering Modular Viral Scaffolds for Targeted Bacterial Population Editing". Cell Systems 1 (3): 187–196. PMC 4785837. PMID 26973885. doi:10.1016/j.cels.2015.08.013. 

Véxase tamén

Ligazóns externas

• Goodsell D (febreiro de 2000). "Bacteriophage phiX174". Molecule of the Month. RCSB-PDB. Arquivado dende o orixinal o 02 de decembro de 2013. Consultado o 14 de agosto de 2022.