Fluoróforo

Unha célula humana etiquetada cun fluoróforo.

Un fluoróforo ou fluorocromo (termo similar a cromóforo) é un composto químico fluorescente que pode reemitir luz cando é excitado pola luz. Os fluoróforos conteñen caracteristicamente varios grupos aromáticos combinados ou moléculas planas ou cíclicas con varios enlaces π.[1]

Os fluoróforos son ás veces usados sós, como trazadores en fluídos, como tinguiduras para tinguir certas estruturas, como substratos dun encima, ou como sondas ou indicadores (cando a súa fluorescencia é afectada por aspectos ambientais como a polaridade ou ións). Pero o máis xeral é que se usen unidos covalentemente a macromoléculas, funcionando como marcadores (ou tinguiduras ou etiquetas ou reporteiros) para reactivos de afinidade ou bioactivos (anticorpos, péptidos, ácidos nucleicos). Os fluoróforos son usados para tinguir tecidos, células ou materiais nunha variedade de métodos analíticos, como na obtención de imaxes fluorescentes e na espectroscopia de fluorescencia.

A fluoresceína, por medio do seu derivado aminorreactivo de isotiocianato, o isotiocianato de fluoresceína (FITC), foi un dos fluoróforos máis utilizados. Desde a súa aplicación inicial para o etiquetado de anticorpos, as aplicacións ampliáronse aos ácidos nucleicos grazas á utilización da carboxifluoresceína. Outros fluoróforos historicamente comúns son os derivados da rodamina (TRITC), coumarina e cianina.[2] As novas xeracións de fluoróforos, moitos dos cales son de marcas comerciais, adoitan ter unhas prestacións mellores, como ser máis fotoestables, máis billantes ou menos sensibles ao pH que as tingjuiduras tradicionais cunha excitación e emisión comparables.[3][4]

Fluorescencia

[editar | editar a fonte]

O fluoróforo absorbe enerxía da luz dunha lonxitude de onda específica e reemite luz dunha lonxitude de onda máis longa. As lonxitudes de onda absorbidas, a eficiencia da transferencia de enerxía, e o tempo antes da emisión dependen da estrutura do fluoróforo e do seu ambiente químico, xa que a molécula no seu estado excitado interacciona coas moléculas que o rodean. As lonxitudes de onda de absorción máxima (≈ excitación) e emisión (por exemplo, Absorión/Emisión = 485 nm/517 nm) son as propiedades típicas usadas para referirse a un fluoróforo determinado, pero o espectro completo pode ser tamén algo importante a considerar. O espectro de lonxitudes de onda de excitación pode ser unha banda moi estreita ou moi ancha ou pode estar todo máis alá do nivel límite. O espectro de emisión é xeralmente máis nítido que o espectro de excitación, e é dunha lonxitude de onda mais longa e, en consecuencia, dunha enerxía menor. As enerxías de excitación van desde o ultravioleta ata o espectro visible, e as enerxías de emisión poden continuar desde a luz visible á rexión do infravermello próximo.

As principais características dos fluoróforos son:

  • Lonxitudes de onda de máxima excitación e emisión (expresada en nanómetros (nm)): corresponde ao pico nos espectros de excitación e emisión (usualmente un pico para cada un).
  • Coeficiente de absorción molar (en mol−1cm−1): liga a cantidade de luz absorbida, a unha lonxitude de onda dada, á concentración de fluoróforo en solución.
  • Rendemento cuántico: eficiencia da enerxía transferida desde a luz incidente á fluorescencia emitida (o número de fotóns emitidos por fotóns absorbidos).
  • Tempo de vida (en picosegundos): duración do estado excitado dun fluoróforo antes de volver ao seu esatado fundamental. Refírese ao tempo que tarda unha poboación de fluoróforos excitados en decaer a 1/e (≈0,368) da cantidade orixinal.
  • Desprazamento de Stokes: a difernza entre as lonxitudes de onda de excitación máxima e emisión máxima.
  • Fracción escura: a proporción das moléculas non activas na emisión de fluorescencia. Para puntos cuánticos, a microscopia de molécula única prolongada mostrou que o 20-90 % de todas as partículas nunca emiten fluorescencia.[5] Por outra parte, as nanopartículas poliméricas conxugadas (Pdots) non mostran case ningunha fracción escura na súa fluorescencia.[6] As proteínas fluorescentes poden ter unha fración escura por mal pregamento da proteína ou formación defectuosa do cromóforo.[7]

Destas carcterísticas derivan outras propiedades, como o fotobranqueamento ou a fotorresistencia (perda de fluorescencia despois dunha excitación continua pola luz). Deberían considerarse igualmente outros parámetros, como a polaridade da molécula fluoróforo, o tamaño e forma do fluoróforo (é dicir, para o padrón de fluorescencia de polarización), e outros factores poden cambiar o comportamento dos fluoróforos.

Os fluoróforos poden usarse tamén para atenuar (quench) a fluorescencia doutras tinguiduras fluorescentes ou para transmitir a súa fluorescencia a lonxitudes de onda incluso máis longas.

Tamaño (peso molecular)

[editar | editar a fonte]

A maioría dos fluoróforos son pequenas moléculas orgánicas de 20–100 átomos (200–1000 daltons (Da); o peso molecular pode ser maior dependendo das modificacións aplicadas e as moléculas conxugadas), pero hai tamén fluoróforos naturais moito máis grandes que son proteínas: a proteína fluorescente verde (GFP) é de 27 kDa, e varias ficobiliproteínas (PE, APC...) son de 240 kDa. En 2020 o fluoróforo máis pequeno coñecido era o 3-hidroxiisonicotinaldehido, un composto de só 14 átomos e só 123 Da.[8]

As partículas fluorescentes como puntos cuánticos (2–10 nm de diámetro, 100–100.000 átomos) son tamén considerdas fluoróforos.[9]

O tamaño do fluoróforo podería ocultar estericamante a molécula etiquetada e afectar a polaridade de fluorescencia.

Familias

[editar | editar a fonte]
Fluorescencia de diversas substancias baixo a luz UV. O composto que dá cor verde é a fluoresceína, o vermello é a Rodamina B, o amarelo é a Rodamina 6G, o azul é a quinina, o púrpura é unha mestura de quinina e Rodamina 6g. As solucións son aproximadamente dunha concentración do 0,001 % en auga.

As moléuculas fluoróforos poden ser utilizadas soas ou servir como motivo fluorescente dun sistema funcional. Baseándose na complexidade molecular e métodos sintéticos, as moléculas fluoróforas poderían ser xeralmente clasificadas en catro categorías: proteínas e péptidos, pequenos compostos orgánicos, oligómeros e polímeros sintéticos, e sistemas multicompoñentes.[10][11]

As proteínas fluorescentes GFP, YFP e RFP (verde, amarela e vermella, respectivamente) poden ser unidas a outras proteínas específicas para formar unha proteína de fusión, sintetizada en células despois da transfección dun plásmido transportador axeitado.

Os fluoróforos orgánicos non proteicos pertencen ás seguintes familias químicas principais:

Estes fluoróforos fluorescen debido a electróns deslocalizados que poden saltar unha banda e estabilizar a enerxía absorbida. Por exemplo, o benceno, un dos hidrocarburos aromáticos máis simples, é excitado a 254 nm e emite a 300 nm.[12] Isto discrimina os fluoróforos dos puntos cuánticos, que son nanopartículas semicondutoras fluorescentes.

Poden ser unidos a proteínas a grupos funcionais específicos, como grupos amino (éster activo, carboxilato, isotiocianato, hidrazina), gruos carboxilo (carbodiimida), tiol (maleimida, bromuro de acetilo) e azida orgánica (por medio de química click ou non especificamente (glutaraldehido)).

Ademais, varios grupos funcionais poden estar presentes para alterar as súas propiedades, como a solubilidade, ou conferir propiedades especiais, como o ácido borónico que se une a azucres ou múltiples grupos carboxilo para enlazar certos catións. Cando a tinguidura contén un doante de electóns e un grupo aceptor de electróns en extremos opostos dun sistema aromático, esta tinguidura probablemente será sensible á polaridade do ambiente (solvatocrómica), polo que se chama sensible ao ambiente. A miúdo as tinguiduras utilízanse dentro das células, que son impermeables a moléculas cargadas; como resultado disto, os grupos carboxilo son convertidos nun éster, que é retirado por esterases dentro das células; por exemplo, fura-2AM e fluoresceína-diacetato.

As seguintes familias de tinguiduras son grupos de marcas comerciais e non necesariamente comparten semellanzas estruturais.

Núcleos de células endoteliais de arteria pulmonar bovina tinguidas de azul con DAPI, mitocondrias tinguidas de vermello con MitoTracker Red CMXRos, e F-actina tinguida de verde con Alexa Fluor 488 faloidina nunha imaxe obtida con microscopio de fluorescencia.

Aplicacións

[editar | editar a fonte]

Os fluoróforos teñen especial importancia no campo de bioquímica e estudos de proteínas, por exemplo, en inmunofluorescencia, análise de células,[13] inmunohistoquímica,[3][14] e sensores de pequenas moléculas.[15][16]

Usos fóra das ciencias da vida

[editar | editar a fonte]
Tinguidura mariña fluorescente

As tinguiduras fluorescentes, que utilizan o nome de "colores neon", atoparon unha ampla variedade de usos na industria, como:

  • Usos de escala multitón en tiguiduras téxtiles e abrillantadores ópticos en deterxentes de lavandaría
  • Formulacións cosméticas avanzadas
  • Roupa e equipos de seguridade
  • Díodos orgánicos emisores de luz (OLEDs)
  • Arte e deseños refinados (pósters e pinturas)
  • Sinerxistas de insecticidas e drogas experimentais
  • Tinguiduras en rotuladores marcadores ou resaltadores de texto para dar un efecto de resplandor
  • Paneis solares para captar máis luz / lonxitudes de onda
  • Tinguiduras mariñas fluorescentes usadas para axudar aos equipos de busca e rescate aéreo a localizar obxectos na auga

Exemplos de fluoroforos que se usan frecuentemente

[editar | editar a fonte]

Tinguiduras reactivas e conxugadas

[editar | editar a fonte]
Tinguidura Ex (nm) Em (nm) PM Notas
Hidroxicoumarina 325 386 331 Succinimidil éster
Aminocoumarina 350 445 330 Succinimidil éster
Metoxicoumarina 360 410 317 Succinimidil éster
Cascade Blue (375);401 423 596 Hidrazida
Pacific Blue 403 455 406 Maleimida
Pacific Orange 403 551
3-Hidroxiisonicotinaldehido 385 525 123 QY 0.15; sensible ao pH
Amarelo Lucifer 425 528
NBD 466 539 294 NBD-X
R-Ficoeritrina (PE) 480;565 578 240 k
Conxugdos PE-Cy5 480;565;650 670 tamén coñecidos como Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red
Conxugados PE-Cy7 480;565;743 767
Red 613 480;565 613 PE-Texas Red
PerCP 490 675 35kDa Proteína peridinina clorofila
TruRed 490,675 695 Conxugados PerCP-Cy5.5
FluorX 494 520 587 (GE Healthcare)
Fluoresceína 495 519 389 FITC; sensible ao pH
BODIPY-FL 503 512
G-Dye100 498 524 axeitado para a etiquetaxe de proteínas e electroforese
G-Dye200 554 575 axeitado para a etiquetaxe de proteínas e electroforese
G-Dye300 648 663 axeitado para a etiquetaxe de proteínas e electroforese
G-Dye400 736 760 axeitado para a etiquetae de proteínas e electroforese
Cy2 489 506 714 QY 0.12
Cy3 (512);550 570;(615) 767 QY 0.15
Cy3B 558 572;(620) 658 QY 0.67
Cy3.5 581 594;(640) 1102 QY 0.15
Cy5 (625);650 670 792 QY 0.28
Cy5.5 675 694 1272 QY 0.23
Cy7 743 767 818 QY 0.28
TRITC 547 572 444 TRITC
X-Rhodamine 570 576 548 XRITC
Lissamine Rhodamine B 570 590
Texas Red 589 615 625 Cloruro de sulfonilo
Aloficocianina (APC) 650 660 104 k
Conxugados APC-Cy7 650;755 767 Far Red

Abreviaturas:

Tinguiduras de ácidos nucleicos

[editar | editar a fonte]
Tinguidura Ex (nm) Em (nm) PM Notas
Hoechst 33342 343 483 616 Selectivo para AT
DAPI 345 455 Selectivo para AT
Hoechst 33258 345 478 624 Selectivo para AT
SYTOX Blue 431 480 ~400 ADN
Cromomicina A3 445 575 Selectivo para CG
Mitramicina 445 575
YOYO-1 491 509 1271
Bromuro de etidio 210;285 605 394 En solución acuosa
GelRed 290;520 595 1239 Substituo non tóxico do brumuro de etidio
Laranxa de acridina 503 530/640 ADN/ARN
SYTOX Green 504 523 ~600 ADN
TOTO-1, TO-PRO-1 509 533 Tinguidura vital, TOTO: dímero de cianina
TO-PRO: monómero de cianina
Laranxa de tiazol 510 530
CyTRAK Orange 520 615 - (Biostatus) (excitación vermella escura)
Ioduro de Propidium (PI) 536 617 668.4
LDS 751 543;590 712;607 472 DNA (543ex/712em), RNA (590ex/607em)
7-AAD 546 647 7-aminoactinomicina D, selectivo para CG
SYTOX Orange 547 570 ~500 ADN
TOTO-3, TO-PRO-3 642 661
DRAQ5 600/647 697 413 (Biostatus) (excitación usable por debaixo de 488)
DRAQ7 599/644 694 ~700 (Biostatus) (excitación usable por debaixo de 488)

Tinguiduras da función celular

[editar | editar a fonte]
Tinguidura Ex (nm) Em (nm) PM Notas
Indo-1 361/330 490/405 1010 AM éster, calcio baixo/alto (Ca2+)
Fluo-3 506 526 855 AM éster. pH > 6
Fluo-4 491/494 516 1097 AM éster. pH 7.2
DCFH 505 535 529 2'7'Dicorodihidrofluoresceína, forma oxidada
DHR 505 534 346 Dihidrorodamina 123, forma oxidada, a luz cataliza a oxidación
SNARF 548/579 587/635 pH 6/9

Proteínas fluorescentes

[editar | editar a fonte]
Tinguidura Ex (nm) Em (nm) PM QY BR PS Notas
GFP (mutación Y66H) 360 442
GFP (mutación Y66F) 360 508
EBFP 380 440 0,18 0,27 monómero
EBFP2 383 448 20 monómero
Azurita 383 447 15 monómero
GFPuv 385 508
T-Sapphire 399 511 0,60 26 25 dímero débil
Cerulean 433 475 0,62 27 36 dímero débil
mCFP 433 475 0,40 13 64 monómero
mTurquoise2 434 474 0,93 28 monómero
ECFP 434 477 0,15 3
CyPet 435 477 0,51 18 59 dímero débil
GFP (mutación Y66W) 436 485
mKeima-Red 440 620 0,24 3 monómero (MBL)
TagCFP 458 480 29 dímero (Evrogen)
AmCyan1 458 489 0,75 29 tetrámero, (Clontech)
mTFP1 462 492 54 dímero
GFP (S65A mutación) 471 504
Midoriishi Cyan 472 495 0,9 25 dímero (MBL)
Wild Type GFP 396,475 508 26k 0,77
GFP (mutación S65C) 479 507
TurboGFP 482 502 26 k 0,53 37 dímero, (Evrogen)
TagGFP 482 505 34 monómero (Evrogen)
GFP (mutación S65L) 484 510
Esmeralda 487 509 0,68 39 0,69 dímero débil, (Invitrogen)
GFP (mutación S65T) 488 511
EGFP 488 507 26k 0,60 34 174 dímero débil, (Clontech)
Azami Green 492 505 0,74 41 monómero (MBL)
ZsGreen1 493 505 105k 0,91 40 tetrámero, (Clontech)
TagYFP 508 524 47 monómero (Evrogen)
EYFP 514 527 26k 0,61 51 60 dímero débil, (Clontech)
Topacio 514 527 57 monómero
Venus 515 528 0,57 53 15 dímero débil
mCitrine 516 529 0,76 59 49 monómero
YPet 517 530 0,77 80 49 dímero débil
TurboYFP 525 538 26 k 0,53 55,7 dímero, (Evrogen)
ZsYellow1 529 539 0,65 13 tetrámero, (Clontech)
Kusabira Orange 548 559 0,60 31 monómero (MBL)
mOrange 548 562 0,69 49 9 monómero
Aloficocianina (APC) 652 657,5 105 kDa 0,68 heterodímero, con enlaces cruzados[17]
mKO 548 559 0,60 31 122 monómero
TurboRFP 553 574 26 k 0,67 62 dímero, (Evrogen)
tdTomato 554 581 0,69 95 98 dímero en tándem
TagRFP 555 584 50 monómero (Evrogen)
DsRed monómero 556 586 ~28k 0,1 3,5 16 monómero, (Clontech)
DsRed2 ("RFP") 563 582 ~110k 0,55 24 (Clontech)
mStrawberry 574 596 0,29 26 15 monómero
TurboFP602 574 602 26 k 0,35 26 dímero, (Evrogen)
AsRed2 576 592 ~110k 0,21 13 tetrámero, (Clontech)
mRFP1 584 607 ~30k 0,25 monómero, (Tsien lab)
J-Red 584 610 0,20 8,8 13 dímero
R-ficoeritrina (RPE) 565 >498 573 250 kDa 0,84 heterotrímero[17]
B-ficoeritrina (BPE) 545 572 240 kDa 0,98 heterotrímero[17]
mCherry 587 610 0,22 16 96 monómero
HcRed1 588 618 ~52k 0,03 0,6 dímero, (Clontech)
Katusha 588 635 23 dímero
P3 Arquivado 21 de agosto de 2024 en Wayback Machine. 614 662 ~10.000 kDa Complexo de ficobilisoma[17]
Peridinina clorofila (PerCP) 483 676 35 kDa trímero[17]
mKate (TagFP635) 588 635 15 monómero (Evrogen)
TurboFP635 588 635 26 k 0,34 22 dímero, (Evrogen)
mPlum 590 649 51,4 k 0,10 4,1 53
mRaspberry 598 625 0,15 13 monómero, fotobranqueamento mais rápido que mPlum
mScarlet 569 594 0,70 71 277 monómero[18]

Abreviaturas:

  • Ex (nm): Lonxitude de onda de excitación en nanómetros
  • Em (nm): Lonxitude de onda de emisións en nanómetros
  • MW: Peso molecular
  • QY: Rendemento cuántico (Quantum yield)
  • BR: Brillantez: Coeficiente de absorción molar * rendemento cuántico / 1000
  • PS: Fotoestabilidade: tempo [seg] para reducir a brillantez nun 50 %

Notas

[editar | editar a fonte]
  1. ↑ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). "Chapter 3 Dyes and Fluorochromes". Fluorescence Microscopy in Life Sciences. Bentham Science Publishers. pp. 61–95. ISBN 978-1-68108-519-7. Consultado o 24 de decembro de 2017. 
  2. ↑ Rietdorf J (2005). Microscopic Techniques. Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology. Berlin: Springer. pp. 246–9. ISBN 3-540-23698-8. Consultado o 2008-12-13. 
  3. ↑ 3,0 3,1 Tsien RY; Waggoner A (1995). "Fluorophores for confocal microscopy". En Pawley JB. Handbook of biological confocal microscopy. Nova York: Plenum Press. pp. 267–74. ISBN 0-306-44826-2. Consultado o 2008-12-13. 
  4. ↑ Lakowicz, JR (2006). Principles of fluorescence spectroscopy (3ª ed.). Springer. p. 954. ISBN 978-0-387-31278-1. 
  5. ↑ Pons T, Medintz IL, Farrell D, Wang X, Grimes AF, English DS, Berti L, Mattoussi H (2011). "Single-molecule colocalization studies shed light on the idea of fully emitting versus dark single quantum dots". Small 7 (14): 2101–2108. PMID 21710484. doi:10.1002/smll.201100802. 
  6. ↑ Koner AL, Krndija D, Hou Q, Sherratt DJ, Howarth M (2013). "Hydroxy-terminated conjugated polymer nanoparticles have near-unity bright fraction and reveal cholesterol-dependence of IGF1R nanodomains". ACS Nano 7 (2): 1137–1144. PMC 3584654. PMID 23330847. doi:10.1021/nn3042122. 
  7. ↑ Garcia-Parajo MF, Segers-Nolten GM, Veerman JA, Greve J, van Hulst NF (2000). "Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules". PNAS 97 (13): 7237–7242. Bibcode:2000PNAS...97.7237G. PMC 16529. PMID 10860989. doi:10.1073/pnas.97.13.7237. 
  8. ↑ Cozens, Tom (2020-12-16). "Fluorescent molecule breaks size record for green-emitting dyes". chemistryworld.com. Consultado o 2021-12-03. 
  9. ↑ Li Z, Zhao X, Huang C, Gong X (2019). "Recent advances in green fabrication of luminescent solar concentrators using nontoxic quantum dots as fluorophores". J. Mater. Chem. C 7 (40): 12373–12387. doi:10.1039/C9TC03520F. 
  10. ↑ Liu, J.; Liu, C.; He, W. (2013). "Fluorophores and Their Applications as Molecular Probes in Living Cells". Curr. Org. Chem. 17 (6): 564–579. doi:10.2174/1385272811317060003. 
  11. ↑ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). "Chapter 4 Fluorescent Labels". Fluorescence Microscopy in Life Sciences. Bentham Science Publishers. pp. 96–134. ISBN 978-1-68108-519-7. Consultado o 24 de decembro de 2017. 
  12. ↑ Omlc.ogi.edu
  13. ↑ Sirbu, Dumitru; Luli, Saimir; Leslie, Jack; Oakley, Fiona; Benniston, Andrew C. (2019). "Enhanced in vivo Optical Imaging of the Inflammatory Response to Acute Liver Injury in C57BL/6 Mice Using a Highly Bright Near-Infrared BODIPY Dye". ChemMedChem (en inglés) 14 (10): 995–999. ISSN 1860-7187. PMID 30920173. doi:10.1002/cmdc.201900181. 
  14. ↑ Taki, Masayasu (2013). "Chapter 5. Imaging and sensing of cadmium in cells". En Astrid Sigel; Helmut Sigel; Roland K. O. Sigel. Cadmium: From Toxicology to Essentiality. Metal Ions in Life Sciences 11. Springer. pp. 99–115. PMID 23430772. doi:10.1007/978-94-007-5179-8_5. 
  15. ↑ Sirbu, Dumitru; Butcher, John B.; Waddell, Paul G.; Andras, Peter; Benniston, Andrew C. (2017-09-18). "Locally Excited State-Charge Transfer State Coupled Dyes as Optically Responsive Neuron Firing Probes" (PDF). Chemistry - A European Journal 23 (58): 14639–14649. ISSN 0947-6539. PMID 28833695. doi:10.1002/chem.201703366. 
  16. ↑ Jiang, Xiqian; Wang, Lingfei; Carroll, Shaina L.; Chen, Jianwei; Wang, Meng C.; Wang, Jin (2018-08-20). "Challenges and Opportunities for Small-Molecule Fluorescent Probes in Redox Biology Applications". Antioxidants & Redox Signaling 29 (6): 518–540. ISSN 1523-0864. PMC 6056262. PMID 29320869. doi:10.1089/ars.2017.7491. 
  17. ↑ 17,0 17,1 17,2 17,3 17,4 "Columbia Biosciences". Arquivado dende o orixinal o 21 de agosto de 2024. Consultado o 21 de agosto de 2024. 
  18. ↑ Bindels, Daphne S.; Haarbosch, Lindsay; van Weeren, Laura; Postma, Marten; Wiese, Katrin E.; Mastop, Marieke; Aumonier, Sylvain; Gotthard, Guillaume; Royant, Antoine; Hink, Mark A.; Gadella, Theodorus W. J. (xaneiro de 2017). "mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging". Nature Methods (en inglés) 14 (1): 53–56. ISSN 1548-7105. PMID 27869816. doi:10.1038/nmeth.4074. 

Véxase tamén

[editar | editar a fonte]

Outros artigos

[editar | editar a fonte]

Ligazóns externas

[editar | editar a fonte]