Inhibición non-competitiva

Non confundir con Inhibición incompetitiva.

A inhibición non-competitiva é un tipo de inhibición encimática na cal o inhibidor reduce a actividade do encima e pode unirse ao encima tanto se este está xa unido ao substrato coma se non.^[1] Isto é diferente da inhibición competitiva, na cal a afinidade de unión ao substrato do encima diminúe en presenza dun inhibidor.

Aínda que o inhibidor pode unirse ao encima tanto se o substrato está xa unido ao encima coma se non, cando ten unha maior afnidade para unirse ao encima nun deses estados, é denominado inhibidor mixto.^[1]

Historia

Leonor Michaelis, durante os anos en que taballou como médico, e o seu amigo Peter Rona construíron un laboratorio compacto no seu hospital, e no decurso de cinco anos Michaelis fixo 100 publicacións. Durante as súas investigacións no hospital, foi o primeiro en decatarse dos diferentes tipos de inhibición; concretamente usndo frutosa e glicosa como inhibidores da actividade da maltase. A maltase rompe a maltosa en dúas unidadeds de glicosa. Os decubrimentos conseguidos neste experimento serviron para ver a diferenza entre a inhibición non-competitiva e a competitiva. A inhibición non-competitiva afecta o valor da k_cat (pero non á K_m) nas gráficas; este inhibidor únese a un sitio que ten especificidade por certa molécula. Michaelis determinou que cando se une o inhibidor, o encima queda inactivado.^[2]

Igual que moitos outros científicos do seu tempo, Leonor Michaelis e Maud Menten traballaron na reacción que se usaba para cambiar a composición da sacarosa e a lisaba dando dous produtos: frutosa e glicosa.^[2] O encima implicado nesta reacción chámase invertase, e é o encima cuxa cinética ía ser revolucionaria para explicar a cinética doutros encimas. Cando expresaban a velocidade da reacción estudada, derivaron unha ecuación que describía a velocidade dunha maneira que suxería que dependía principalmente da concentración do encima, así como da presenza do substrato, pero só ata certo punto.^[2][3]

Adrian John Brown e Victor Henri sentaron as bases para o descubrimento da cinética encimática pola que son coñecidos Michaelis e Menten.^[4] Brown concibiu teoricamente o mecanismo agora aceptado para a cinética encimática, pero non tiña datos cuantitativos para proclamalo.^[4] Victor Henri fixo contribucións significativas á cinética encimática durante a súa tese de doutoramento, aínda que non sinalaron a importancia das concentracións de ión hidróxeno e a mutarrotación da glicosa. O obxectivo da tese de Henri era comparar os seus coñecementos sobre as reaccións catalizadas por encimas coas leis recoñecidas pola química física.^[2] A Henri atribúeselle ser o primeiro en escribir a ecuación que agora se coñece como ecuación de Michaelis-Menten. Usando a glicosa e a frutosa nas reaccións catalíticas controladas pola maltase e a invertase, Leonor Michaelis foi o primeiro científico en distinguir os diferentes tipos de inhibición usando a escala de pH, que non existía nos tempos de Henri.^[2]

Durante o seu traballo de descrición da velocidade desta reacción, eles tamén testaron e extrapolaron a idea do científico Victor Henri de que ese encima que estaban usando tiña algunha afinidade por ambos os produtos desta reacción: frutosa e glicosa.^[2][3] Usando os métodos de Henri, Michaelis e Menten perfeccionaron este concepto do método da velocidade inicial para os experimentos de estado estacionario. Estudaron a inhibición e atoparon que a inhibición non-competitiva (mixta) se caracteriza polo seu efecto sobre a k_cat (velocidade de catalizador) mentes que a competitiva se caracteriza polo seu efecto sobre a velocidade (V).^[2] Os experimentos de Michaelis e Menten centráronse principalmente nos efectos do pH na invertase usando ións hidróxeno.^[2] A invertase é un encima atopado en extractos extracelulares de lévedos que catalizaba unha reacción por hidrólise ou invertía a sacarosa a “azucre invertido.” A razón principal para usar a invertase era que con esta podían facerse doadamente ensaios e os experimentos podían realizarse con maior rapidez. A sacarosa compórtase nos polarímetros como dextrorrotatoria ou D mentres que o azucre invertido é levorrotatoria ou L. Isto facía que rastrear a inversión do azucre fose relativamente sinxelo. Tamén atoparon que nas reaccións catalizadas pola invertase se liberaba α-D-glicosa, a cal é moi inestable e cambia espontaneamente a β-D-glicosa.^[4] Aínda que están ambas na forma dextrorrotatoria, isto foi polo que eles se decataron que a glicosa pode cambiar espontaneamente, o que se chama mutarrotación. O feito de que antes non se tivese en conta foi unha das principais razóns de que os experimentos de Henri quedasen curtos. Usando a invertase para catalizar a inversión da sacarosa, podían ver a rapidez coa que estaba reaccionando o encima por polarimetía; polo tanto, puideron comprobar que a inhibición non-competitiva ocorría na reacción na que a sacarosa era invertida pola invertase.^[2]

Terminoloxía

É importante sinalar que mentres que todos os inhibidores non-competitivos se unen ao encima en sitios alostéricos (é dicir, localizacións distintas do seu sitio activo), non todos os inhibidores que se unen a un sitio alostérico son inhibidores non-competitivos.^[1] De feito, os inhibidores alostéricos poden actuar como inhibidores competitivos, non-competitivos ou incompetitivos (acompetitivos).^[1]

En ocasións a terminoloxía é algo confusa, porque moitas fontes continúan a fundir estes dous termos (alostérico, non-competitivo),^[5] ou dan unha definición de inhibición alostérica como definición de inhibición non-competitiva.

Mecanismo

Ilustración dun posible mecanismo de inhibición non-competitiva ou inhibición mixta.

A inhibición non-competitiva modeliza un sistema no que o inhibidor e o substrato poden estar ambos unidos ao encima nun momento dado. Cando están unidos tanto o substrato coma o inhibidor, o complexo encima-substrato-inhibidor non pode formar o produto e só pode converterse de novo no complexo encima-substrato ou o complexo encima-inhibidor. A inhibición non-competitiva distínguese da inhibición mixta xeral en que o inhibidor ten unha afinidade igual polo encima que polo complexo encima-substrato.

Por exemplo, nas reaccións catalizadas por encimas da glicólise, a acumulación de fosfoenolpiruvato é catalizada pola piruvato quinase para formar piruvato. A alanina é un aminoácido que se sintetiza a partir do piruvato e tamén inhibe o encima piruvato quinase durante a glicólise. A alanina é un inhibidor non-competitivo, polo tanto únese fóra do sitio activo ao substrato para que este siga sendo o produto final.^[6]

Outro exemplo de inhibición non-competitiva é o da inhibición pola glicosa 6-fosfato da hexoquinase no cerebro. Os carbonos 2 e 4 da glicosa 6-fosfato conteñen grupos hidroxilo que se unen xunto co fosfato ao carbono 6 do complexo encima-inhibidor. O substrato e o encima son diferentes nas combinacións de grupos ás que se une o inhibidor. A capacidade da glicosa 6-fosfato de unirse en diferentes lugares ao mesmo tempo fai que sexa un inhibidor non-competitivo.^[7]

O mecanismo máis común de inhibición non-competitiva implica a unión reversible do inhibidor a un sitio alostérico, pero é posible que o inhibidor funcione por outros medios, como pode ser a unión directa ao sitio activo. Diferénciase da inhibición competitiva en que a unión do inhibidor non impide a unión do substrato, e viceversa, senón que simplemente impide a formación do produto durante un período de tempo limitado.

Este tipo de inhibición reduce a velocidade máxima dunha reacción química sen cambiar a afinidade de unión aparente do catalizador polo substrato (K_m^ap ; ver cinética de Michaelis-Menten). Cando se engade o inhibidor non-competitivo, a V_max cambia, mentres que a K_m permanece inalterada. De acordo coa gráfica de Lineweaver-Burk, a V_max redúcese durante a adición dun inhibidor non-competitivo, que se mostra na gráfica por un cambio na pendente e no punto de corte co eixe Y cando se engade un inhibidor non-competitivo.^[8]

A diferenza primaria entre a inhibición competitiva e non-competitiva é que a competitiva afecta a capacidade do substrato de unirse a un inhibidor en lugar do substrato, o cal rebaixa a afinidade do encima polo substrato. Na inhibición non-competitiva, o inhibidor únese a un sitio alostérico e impide que o complexo encima substrato realice a reacción química. Isto non afecta a K_m (afinidade) do encima (polo substrato). A inhibición non-competitiva difire da incompetitiva en que permite que o substrato se una ao complexo encima-inhibidor e forme un complexo encima-substrato-inhibidor, o cal non é así na inhibición incompetitiva, a cal impide que o substrato se una ao inhibidor do encima por medio dun cambio conformacional por unión alostérica.

Ecuación

En presenza dun inhibidor non-competitivo, a afinidade aparente do encima equivale á afinidade real. En termos da cinética de Michaelis-Menten, K_m^ap = K_m. Isto pode considerarse unha consecuencia do principio de Le Chatelier porque o inhibidor se une igualmente tanto ao encima coma ao complexo encima-substrato para que o equilibrio se manteña. Porén, como algúns encimas están sempre inhibidos e non converten o substrato en produto, a concentración efectiva do encima está diminuída.

Matematicamente,

${\displaystyle V_{max}^{ap}={\frac {V_{max}}{1+{\frac {[I]}{K_{I}}}}}}$

${\displaystyle {aparente\ [E]_{0}}={\frac {[E]_{0}}{1+{\frac {[I]}{K_{I}}}}}}$

Exemplo: inhibidores non-competitivos do encima CYP2C9

Inhibidores non-competitivos do encima CYP2C9 son a nifedipina, a tranilcipromina, o fenetil isotiocianato e a 6-hidroxiflavona. As simulacións por computador e os mutantes substituídos construídos indican que o sitio de unión non-competitiva da 6-hidroxiflavona é o sitio de unión alostérico do encima CYP2C9.^[9]

Notas

1. Strelow J, Dewe W, Iversen PW, Brooks HB, Radding JA, McGee J, Weidner J (2004). "Mechanism of Action Assays for Enzymes". En Markossian S, Grossman A, Brimacombe K, Arkin M, Auld D, Austin CP, et al. Assay Guidance Manual. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. PMID 22553872. 
2. Cornish-Bowden A (2015-03-01). "One hundred years of Michaelis–Menten kinetics". Perspectives in Science. Proceedings of the Beilstein ESCEC Symposium - Celebrating the 100th Anniversary of Michaelis Menten-Kinetics 4 (Supplement C): 3–9. doi:10.1016/j.pisc.2014.12.002. 
3. Michaelis L, Menten MM (setembro de 2013). "The kinetics of invertin action. 1913". FEBS Letters 587 (17): 2712–2720. PMID 23867202. doi:10.1016/j.febslet.2013.07.015. 
4. Cornish-Bowden A (setembro de 2013). "The origins of enzyme kinetics". FEBS Letters. A century of Michaelis - Menten kinetics 587 (17): 2725–2730. PMID 23791665. doi:10.1016/j.febslet.2013.06.009. 
5. "Noncompetitive inhibition and allosteric inhibition". Biology Online (forum). Arquivado dende o orixinal o 25 de abril de 2015. Consultado o 2 de abril de 2012. 
6. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L (2002). "The Glycolytic Pathway Is Tightly Controlled". Biochemistry (en inglés) (5ª ed.). 
7. Crane RK, Sols A (outubro de 1954). "The non-competitive inhibition of brain hexokinase by glucose-6-phosphate and related compounds" (PDF). The Journal of Biological Chemistry 210 (2): 597–606. PMID 13211596. doi:10.1016/S0021-9258(18)65385-2. 
8. Waldrop GL (xaneiro de 2009). "A qualitative approach to enzyme inhibition". Biochemistry and Molecular Biology Education 37 (1): 11–5. PMID 21567682. doi:10.1002/bmb.20243. 
9. Si D, Wang Y, Zhou YH, Guo Y, Wang J, Zhou H, et al. (marzo de 2009). "Mechanism of CYP2C9 inhibition by flavones and flavonols" (PDF). Drug Metabolism and Disposition (American Society for Pharmacology & Experimental Therapeutics (ASPET)) 37 (3): 629–634. PMID 19074529. doi:10.1124/dmd.108.023416. Arquivado dende o orixinal (PDF) o 17 de decembro de 2008. Consultado o 25 de outubro de 2024.