Inmunofluorescencia

Fotomicrografía dunha preparación histolóxica de pel humana preparada para inmunofluorescencia directa usando un anticorpo anti-IgA. A pel era dun paciente con púrpura de Henoch–Schönlein: encóntranse depósitos de IgA nas paredes de pequenos capilares superficiais (frechas amarelas). A área ondulada verde clara de arriba é a epiderme, a área fibrosa de abaixo é o derma.

Estas figuras mostran os mecanismos básicos da inmunofluorescencia. A inmunofluorescencia primaria ilústrase á esquerda, e mostra un anticorpo cun grupo fluoróforo ligado a el unido directamente ao epítopo dun antíxeno para o cal é específico. Unha vez que o anticorpo se uniu ao epítopo, a mostra pode verse no microscopio de fluorescencia para confirmar a presenza do antíxeno na mostra. Inversamente, a inmunofluorescencia secundaria que se mostra á dereita, vese primeiro como un anticorpo primario non etiquetado se une ao epítopo do antíxeno por un mecanismo similar ao descrito arriba. Porén, despois de que os anticorpos primarios se uniron ás súas dianas, aparece un anticorpo secundario (etiquetado cun fluoróforo). Estes sitios específicos de unión do anticorpo secundario son específicos para o anticorpo primario que xa está unido ao antíxeno, e, por tanto, o anticorpo secundario únese ao anticorpo primario. Este método permite que máis anticorpos etiquetados con fluoróforo se unan á diana, o que incrementa o sinal fluorescente durante a micoscopía.

A inmunofluorescencia é unha técnica usada en microscopía óptica con microscopio de fluorescencia, que se aplica principalmente a mostras microbiolóxicas. Esta técnica usa a especificidade dos anticorpos co seu antíxeno para dirixir tinguiduras fluorescentes a biomoléculas diana específicas que se encontran dentro da célula, o que permite a visualización da distribución da molécula diana pola mostra. A rexión específica que recoñece un anticorpo sobre un antíxeno denomínase epítopo.^[1] Houbo que facer grandes esforzos para poñer a punto o mapado de epítopos, xa que moitos anticorpos poden unirse ao mesmo epítopo e o grao de unión entre anticorpos que recoñecen o mesmo epítopo pode variar.^[2] Adicionalmente, a unión dun fluoróforo ao anticorpo non pode interferir coa especificidade inmunolóxica do anticorpo ou a capacidade de unión ao seu antíxeno.^[3] A inmunofluorescencia é un exemplo moi utilizado de inmunotinguidura (uso de anticorpos para marcar proteínas) e é un exemplo específico de inmunohistoquímica (uso da relación anticorpo-antíxeno nos tecidos). Esta técnica fai uso principalmente de fluoróforos para visualizar a localización dos anticorpos.^[4]

A inmunofluorescencia pode utilizarse en cortes de tecidos, liñas celulares cultivadas ou células individuais, e pode servir para analizar a distribución de proteínas, glicanos e pequenas moléculas biolóxicas e non bioloxicas. Esta técnica pode incluso utilizarse para visualizar estruturas como os filamentos intermedios do citoesqueleto.^[5] Se aínda non se determinou a topoloxía dunha membrana plasmática, pode utilizarse a inserción de epítopos nas proteínas en conxunción coa inmunofluorescencia para determinar estruturas.^[6] A inmunofluorescencia pode usarse tamén como método "semicuantitativo" para estudar os niveis e padróns de localización da metilación do ADN, pero é un método que require máis tempo que os métodos verdadeiramente cuantitativos e hai certa subxectividade na análise dos niveis de metilación.^[7] A inmunofluorescencia pode aplicarse en combinación con outros métodos de marcaxe fluorescente que non usan anticorpos, por exemplo, o DAPI para etiquetar o ADN. Para a análise de mostras de inmunofluorescencia poden utilizarse varios deseños de microscopios; o máis simple son o microscopio de epifluorescencia e o microscopio confocal. Disponse tamén de varios deseños de microscopio de super-resolución igualmente útiles nos estudos de inmunofluorescencia.^[8]

Tipos

Fotomicrografía dun corte histolóxico da pel humana preparada para a inmunofluorescencia directa usando un anticorpo anti-IgG. A pel é dun paciente de lupus eritematoso sistémico e mostra depósitos de IgG en dous lugares: o primeiro é un depósito con forma de banda que discorre ao longo da membrana basal epidérmica (polo que a "proba da banda de lupus" é positiva); a segunda está dentro dos núcleos das células epidérmicas (anticorpos antinucleares).

Preparación da fluorescencia

Para producir anticorpos etiquetados con fluorocromo, debe conxugarse ("etiquetaxe ou marcaxe") un fluorocromo co anticorpo. Igualmente, un antíxeno pode conxugarse tamén co anticorpo cunha sonda fluorescente nunha técnica chamada técnica do antíxeno fluorescente. Os procedementos de marcaxe fluorescente poden aplicarse tanto a antíxenos fixados no citoplasma coma a antíxenos da superficie celular de células vivas, o que se chama "inmunofluorescencia de membrana". Tamén é posible etiquetar o complemento do complexo antíxeno-anticorpo cunha sonda de fluorescencia. Ademais dos elementos aos cales están unidos as sondas de fluorescencia, hai dúas clases xerais de técnicas de inmunofluorescencia: primaria (ou directa) e secundaria (ou indirecta). As seguintes descricións céntranse principalmente nesas clases en termos de anticorpos conxugados.^[3]

Distinguiremos, pois, dúas clases de técnicas de inmunofluorescencia: directa (ou primaria) e indirecta (ou secundaria).

Directa ou primaria

A inmunofluorescencia directa ou primaria usa un só anticorpo, primario, quimicamente ligado a un fluoróforo. O anticorpo primario recoñece a molécula diana (antíxeno) e únese a unha rexión específica chamada epítopo. O fluoróforo unido pode ser detectado por microscopía fluorescente, a cal, dependendo do mensaxeiro usado, emitirá ao ser excitado unha luz de lonxitude de onda específica.^[9] A inmunofluorescencia directa, aínda que algo menos común, ten notables vantaxes sobre o procedemento indirecto ou secundario. A unión directa do mensaxeiro ao anticorpo reduce o número de pasos no procedemento, aforrando tempo e reducindo o sinal de fondo non específico.^[10] Isto tamén limita a posibilidade de reactividade cruzada do anticorpo e posibles erros durante o proceso.

Porén, hai algunhas desvantaxes neste método. Como o número de moléculas fluorescentes que pode estar unido a un anticorpo primario é limitado, a inmunofluorescencia directa é substancialmente menos sensible que a indirecta e pode orixinar falsos negativos. A inmunoflorescencia directa tamén require o uso de moita máis cantidade de anticorpo primario, o cal é extremadamente caro.

Indirecta ou secundaria

Tinguidura fluorescente para a proteína actina no músculo liso da pel.

A inmunofluorescencia indirecta ou secundaria utiliza dous anticorpos; o primeiro anticorpo non etiquetado (primario) únese especificamente á molécula diana, e o anticorpo secundario, que leva o fluoróforo, recoñece o anticorpo primario e únese a el. Poden unirse múltiples anticorpos secundarios a un só anticorpo primario. Isto proporciona unha amplificación do sinal ao incrementar o número de moléculas de fluoróforos por antíxeno.^[10] Este protocolo é máis complexo e leva moito máis tempo que o protocolo directo ou primario explicado antes, pero permite máis flexibilidade porque pode utilizarse unha variedade de distintos anticorpos secundarios e as técnicas de detección para un determinado anticorpo primario.^[10]

Este protocolo é posible porque un anticorpo consta de dúas partes, unha rexión variable (que recoñece o antíxeno) e unha rexión constante (que determina a estrutura da molécula do anticorpo). En realidade a molécula de anticorpo ten catro cadeas polipeptídicas: dúas cadeas pesadas e dúas lixeiras. Un investigador pode xerar varios anticorpos primarios que recoñecen varios antíxenos (teñen diferentes rexións variables), pero que todos comparten a mesma rexión constante. Todos estes anticorpos poden, por tanto, ser recoñecidos por un só anticorpo secundario. Isto aforra o custo de modificar os anticorpos primarios para que porten directamente o fluoróforo.

Xéranse diferentes anticorpos primarios con diferentes rexións constantes tipicamente estimulando a produción do anticorpo en diferentes especies. Por exemplo, poderíase crear anticorpos primarios nunha cabra que recoñecen varios antíxenos, e despois empregar anticorpos secundarios de coello acoplados á tinguidura, que recoñecen a rexión constante do anticorpo de cabra (anticorpos de "coello anti-cabra"). Pódese despois crear un segundo conxunto de anticorpos primarios nun rato que poderían ser recoñecidos por un anticorpo secundario separado de "burro anti-rato". Isto permite a reutilización en múltiples experimentos dos difíciles de producir anticorpos acoplados a tinguidura.

Limitacións

Como ocorre coa maioría das técnicas florescentes, un problema significativo na inmunofluorescencia é o fotoblanqueo (photobleaching). A perda de actividade causada polo fotoblanqueo pode ser controlada reducindo ou limitando a intensidade ou a duración temporal da exposición á luz, incrementando a concentración dos fluoróforos ou empregando fluoróforos máis robustos que teñen menor tendencia a blanquearse (por exemplo, Alexa Fluors, Seta Fluors ou DyLight Fluors). Algúns problemas que poden xurdir nesta técnica son a autofluorescencia, a fluorescencia específica non desexada superflua e a fluorescencia non específica. A autofluorescencia inclúe a fluorescencia emitida desde o propio tecido ou célula mostra. A fluorescencia específica non desexada superflua aparece cando un antíxeno diana é impuro e contén contaminantes antixénicos (superfluos ou estraños). A fluorescencia non específica implica a perda da especificidade dunha sonda debido ao fluoróforo, a partir da fixación impropia ou a partir dun espécime desecado.^[3]

A inmunofluorescencia só está limitada a células fixadas (é dicir, mortas) cando estruturas do interior da célula teñen que ser visualizadas porque os anticorpos non penetran a través da membrana plasmática cando reaccionan coas etiquetas florescentes. O material antixénico debe ser fixado firmemente no sitio da súa localización natural dentro da célula.^[3] Os anticorpos intactos poden tamén ser demasiado grandes para tinguir células cancerosas in vivo.^[11] O seu tamaño ten como resultado unha lenta penetración no tumor e vida media circulante longa. Investigouse no uso dos chamados diacorpos (diabodies) para sortear esta limitación.^[11] Como as proteínas do sobrenadante ou do exterior da membrana plasmática poden unirse aos anticorpos, isto permite tinguir células vivas. Dependendo do fixador que se use, as proteínas de interese poderían establecer enlaces cruzados entre elas e isto podería ter como resultado sinais de falso positivo ou falso negativo debido a unións non específicas.

Unha estratexia alternativa é utilizar proteínas recombinantes que conteñen dominios de proteína fluorescente, por exemplo, a proteína fluorescente verde (GFP). O uso de ditas proteínas "etiquetadas" serve para a determinación das súas localizacións dentro da célula viva. Aínda que isto parece ser unha alternativa elegante á inmunofluorescencia, as células teñen que se transfectadas ou transducidas coa etiqueta GFP, e como consecuencia convértense en organismos con risco de seguridade biolóxica 1 ou S1 (ou incluso un nivel superior), que requiren aplicar máis estritos estándares de seguridade no laboratorio. Esta técnica implica a alteración da información xenética das células.^[12]

Avances

Moitas dos avances neste método dependen das melloras nos microscopios de fluorescencia e os fluoróforos. Os métodos de super-resolución dependen da capacidade dun microscopio de producir unha resolución por debaixo do límite de Abbe (un límite que ten a luz debido á súa lonxitude de onda). Este límite de difracción é duns 200-300 nm na dirección lateral e de 500-700 nm na dirección axial. Este límite é comparable ou maior que algunhas estruturas da célula, e en consecuencia, este límite impide determinar detalles da súa estrutura.^[13] A super-resolución en fluorescencia, máis especificamente, refírese á capacidade dun microscopio de impedir a fluorescencia simultánea de fluoróforos adxacentes espectralmente idénticos.^[13][14] Exemplos de métodos de microscopía de fluorescencia de super-resolución desenvolvidos recentemente son a microscopía de depleción de emisión estimulada (STED), a microscopía de iluminación estruturada saturada (SSIM), a microscopía de localización de fotoactivación de fluorescencia (FPALM), e a microscopía de reconstrución óptica estocástica (STORM).^[15]

Notas

1. Mandrell, R. E.; Griffiss, J. M.; Macher, B. A. (1988-07-01). "Lipooligosaccharides (LOS) of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis have components that are immunochemically similar to precursors of human blood group antigens. Carbohydrate sequence specificity of the mouse monoclonal antibodies that recognize crossreacting antigens on LOS and human erythrocytes.". Journal of Experimental Medicine (en inglés) 168 (1): 107–126. ISSN 0022-1007. PMC 2188965. PMID 2456365. doi:10.1084/jem.168.1.107. 
2. Ladner, Robert C. (2007-01-01). "Mapping the Epitopes of Antibodies". Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 24 (1): 1–30. ISSN 0264-8725. doi:10.1080/02648725.2007.10648092. 
3. Akiyoshi., Kawamura, (1983-01-01). Immunofluorescence in medical science : with 28 tab. Springer u.a. ISBN 3540124837. OCLC 643714056. 
4. "Immunofluorescence". Protocol Online. 
5. Franke, W. W.; Schmid, E.; Osborn, M.; Weber, K. (1978-10-01). "Different intermediate-sized filaments distinguished by immunofluorescence microscopy". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 75 (10): 5034–5038. ISSN 0027-8424. PMC 336257. PMID 368806. doi:10.1073/pnas.75.10.5034. 
6. Wang, Honggang; Lee, Eun-Woo; Cai, Xiaokun; Ni, Zhanglin; Zhou, Lin; Mao, Qingcheng (2008-12-30). "Membrane Topology of the Human Breast Cancer Resistance Protein (BCRP/ABCG2) Determined by Epitope Insertion and Immunofluorescence". Biochemistry 47 (52): 13778–13787. ISSN 0006-2960. PMC 2649121. PMID 19063604. doi:10.1021/bi801644v. 
7. Çelik, Selcen (2015-01-01). "Understanding the complexity of antigen retrieval of DNA methylation for immunofluorescence-based measurement and an approach to challenge". Journal of Immunological Methods 416: 1–16. doi:10.1016/j.jim.2014.11.011. 
8. "Immunofluorescence Method". Davidson College. Arquivado dende o orixinal o 28 de decembro de 2016. Consultado o 24 de marzo de 2018. 
9. "Immunohistochemical Staining Methods". IHC Guidebook (PDF) (Sixth ed.). Dako Denmark A/S, An Agilent Technologies Company. 2013. Arquivado dende o orixinal (PDF) o 03 de agosto de 2016. Consultado o 24 de marzo de 2018. 
10. Fritschy J, Härtig W (2001). "Immunofluorescence". ELS. ISBN 978-0-470-01590-2. doi:10.1038/npg.els.0001174. Arquivado dende o orixinal o 02 de xullo de 2017. Consultado o 24 de marzo de 2018. 
11. Sonn GA, Behesnilian AS, Jiang ZK, Zettlitz KA, Lepin EJ, Bentolila LA, Knowles SM, Lawrence D, Wu AM, Reiter RE (2016). "Fluorescent Image-Guided Surgery with an Anti-Prostate Stem Cell Antigen (PSCA) Diabody Enables Targeted Resection of Mouse Prostate Cancer Xenografts in Real Time". Clinical Cancer Research 22 (6): 1403–12. PMC 4794340. PMID 26490315. doi:10.1158/1078-0432.CCR-15-0503. 
12. Chalfie, Martin (1995-10-01). "Green Fluorescent Protein". Photochemistry and Photobiology (en inglés) 62 (4): 651–656. ISSN 1751-1097. doi:10.1111/j.1751-1097.1995.tb08712.x. 
13. Huang, Bo; Bates, Mark; Zhuang, Xiaowei (2009-06-02). "Super-Resolution Fluorescence Microscopy". dx.doi.org (en inglés). PMC 2835776. PMID 19489737. doi:10.1146/annurev.biochem.77.061906.092014. Consultado o 2017-03-24. 
14. 1959-, Diaspro, Alberto,; van,, Zandvoort, Marc A. M. J. Super-resolution imaging in biomedicine. ISBN 9781482244359. OCLC 960719686. 
15. Leung, Bonnie O.; Chou, Keng C. (2011-09-01). "Review of Super-Resolution Fluorescence Microscopy for Biology". Applied Spectroscopy (en inglés) 65 (9): 967–980. ISSN 0003-7028. doi:10.1366/11-06398. 

Véxase tamén

Outros artigos

• Inmunoquímica

Ligazóns externas

• Imaxes asociadas con enfermidades autoinmunes Arquivado 25 de setembro de 2009 en Wayback Machine. da Universidade de Birmingham
• Protocolo de tinguidura de inmunofluorescencia Arquivado 21 de agosto de 2008 en Wayback Machine.
• Resumo do Davidson College
• Immunofluorescence Medical Subject Headings (MeSH) na Biblioteca Nacional de Medicina dos EUA.
• SynD - Detección de neurita e sinapse automática en imaxes de inmunofluorescencia