Northwestern blot

O northwestern blot, tamén chamado ensaio northwestern, é unha técnica analítica de bioloxía molecular híbrida entre o western blot e o northern blot, que se utiliza para detectar as interaccións entre o ARN e as proteínas. A técnica relacionada do western blot utilízase para detectar proteínas de interese realizando unha transferencia a unha membrana de nitrocelulosa de ditas proteínas, que son separadas previamente por electroforese en xel. Os grupos de precipitados coloreados ao longo das bandas que quedan sobre a membrana conteñen unha determinada proteína diana. O northern blot é unha técnica similar que, en vez de detectar unha proteína de interese, úsase para estudar a expresión xénica pola detección de ARN (ou ARNm illado) sobre unha membrana similar á do western blot. Pola súa parte, o northwestern blot combina as dúas técnicas, e implica especificamente a identificación de ARN etiquetado que interacciona con proteínas que son inmobilizadas nunha membrana de nitrocelulosa similar. Serve para separar proteínas que interaccionan co ARN.

Historia

[editar | editar a fonte]

O científico Edwin Southern foi o creador da primeira técnica de blotting ou transferencia, que se denominou co seu apelido Southern blot (transferencia de Southern),[1] que era unha técnica analítica utilizada para detectar ADN. A técnica requiría usar electroforese en xel, un importante método analítico que implica a migración de ADN, ARN ou proteínas cargados a través dun campo eléctrico, que se separan baseándose no seu tamaño e carga.[2] No Southern blot, os fragmentos de ADN separados son despois transferidos a unha membrana de filtración para a detección.[1] Detéctanse como bandas que se fan visibles na membrana e correlaciónanse cunha determinada molécula de interese.[2] Posteriormente, apareceron outras técnicas de blotting que se nomearon facendo un xogo de palabras co apelido Southern e os nomes dos puntos cardinais en inglés, que servían par detectar outras moléculas ou as interaccións entre moléculas. Entre elas están o western blot (para detección de proteínas), o northern blot (detección de ARN), o southwestern blot (detección da interacción ADN-proteína), o eastern blot (detección de modificacións postraducionais) e a northwestern blot (detección de interacción ARN-proteína). Estas técnicas escríbense con frecuencia con maiúscula, facendo unha analoxía co Southern blot.[3][4][5][6]

Especificidades da técnica

[editar | editar a fonte]

Realizar un northwestern blot implica separar as proteínas que se unen ao ARN por medio de electroforese en xel, que as sepra bseándose no seu tamaño e carga. Cada mostra debe cargarse nos pozos dun xel de agarosa ou poliacrilamida (xeralmente para facer unha SDS-PAGE) para analizar múltiples mostras ao mesmo tempo.[5] Unha vez que se completou a electroforese en xel, o xel e as proteínas que se unen ao ARN asociadas son transferidas a un papel ou lámina de nitrocelulosa.[7]

Os blots acabados de transferir son despois mergullados nunha solución bloqueante; tampóns bloqueantes comúns son o leite desnatado e a seroalbumina bovina.[8] Esta solución bloqueante axuda a impedir que se produzan unións non específicas cos anticorpos primarios ou secundarios da membrana de nitrocelulosa. Unha vez que se deixou que a solución bloqueante tivese un tempo adecuado de contacto co blot, aplícase un ARN competidor específico e déixase tempo para que incube á temperatura dunha habitación. Durante este tempo, o ARN competidor únese ás proteínas que se unen ao ARN nas mostras do blot. O tempo de incubación durante este proceso pode variar dependendo da concentración do ARN competidor aplicado, pero adoita ser dunha hora.[9] Despois de completada a incubación, o blot adoita lavarse polo menos tres veces durante 5 minutos en cada lavado, para diluír e retirar o ARN da solución. Tampóns de lavado comúns son o salino tamponado con fosfato (PBS) ou unha solución ao 10% de Tween 20.[10] Un lavado incorrecto afecta á claridade do revelado do blot. Unha vez rematado o lavado, o blot revélase despois con raios X ou métodos similares de autorradiografía.[11]

Aplicacións

[editar | editar a fonte]

Despois de revelar o blot usando raios X ou autorradiografía, os resultados poden anlizarse e interpretarse para determinar o tamaño proximado e concentración das proteínas de interese que se unen o ARN para realizar un posterior estudo das mesmas. A localización e concentración das proteínas que se unen ao ARN no blot poden afectar os resultados, e por veces poden aparecer bandas despois do revelado. Estas bandas poden axudar aos investigadores a determinr o tamaño e a concentración das proteínas que se unen ao ARN de interese.[12] Cando se coñece o tamaño aproximado da proteína, a mostra orixinal pode facerse pasar por unha máquina de cromatografía para separala por tamaño.[13] Ademais, unha vez que se illa a proteína, pode dixerirse con tripsina, e pode utilizarse a espectrometría de masas para secuenciar os péptidos e determinar a identidade da proteína específica.[14]

Vantaxes e desvantaxes

[editar | editar a fonte]

Entre as vantaxes que teñen os northwestern blots están a detección rápida de proteínas específicas que se unen ao ARN e a estimación dos pesos moleculares aproximados de ditas proteínas.[15] O northwestern blot permite a detección de proteínas identificadas de forma barata. O blot é normalmente o primeiro paso que se realiza nunha investigación, xa que permite a identificación dos pesos moleculares aproximados, e unha vez que se coñece o peso molecular permite posteriores investigacións ou purificacións usando outros métodos como a cromatografía. Outra vantaxe do northwestern blot é que axuda a construír bibliotecas de expresión de ligandos cognados.[16]

Unha desvantaxe que se ten sinalado é que algunhas interaccións ARN-proteína con propiedades de unión ao ARN malas poden non ser detectables con esta técnica.[15] Ademais, o procedemento do blotting pode tardar de 3 a 5 horas. Se o procedemento non se fai correctamente pode causar un significativo fondo que pode orixinar un blot pouco claro das proteínas identificadas. Adicionalmente, as proteínas necesitan renaturalizrse antes de ser separadas e transferidas á membrana de nitrocelulosa. Unha última desvantaxe é que as proteínas deben constar dun só polipéptido ou de dúas subunidades que comigran na matriz do xel.[17]

Notas

[editar | editar a fonte]
  1. ↑ 1,0 1,1 Southern, Edwin Mellor (5 November 1975). "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis". Journal of Molecular Biology 98 (3): 503–517. ISSN 0022-2836. PMID 1195397. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0. 
  2. ↑ 2,0 2,1 Nelson, Cox (2013). Lehninger Principles of Biochemistry. New York, NY: W.H. Freeman and Company. p. 179. ISBN 978-1-4641-0962-1. 
  3. ↑ Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell, 5th ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538-539.
  4. ↑ Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. (1997) An Improved, Rapid Northern Protocol. Biochem. and Biophys. Research Comm. 238:277-279.
  5. ↑ 5,0 5,1 Rapley, R (2000). The Nucleic Acid Protocols Handbook. Totowa, NJ: Humana Press Inc. p. 783. ISBN 0-89603-459-3. 
  6. ↑ Nicholas; Nelson (2013). "North, South, or East? Blotting Techniques". Journal of Investigative Dermatology 133 (e10): e10. doi:10.1038/jid.2013.216. 
  7. ↑ Verena, Bichsel; Alfred Walz; Matthias Bickel (1997). "Identification of proteins binding specifically to the 3'-untranslated region of granulocyte/macrophage-colony stimulating factro mRNA" (PDF). Nucleic Acids Research 25 (12): 2417–2423. PMC 146745. PMID 9171094. doi:10.1093/nar/25.12.2417. Consultado o 7 May 2014. 
  8. ↑ Liao, Huey-Jane; Ryuji Kobyashi and Michael B. Matthews; Mathews, M. B. (July 21, 1998). "Activities of adenovirus virus-associated RNAs: Purification and characterization of RNA binding proteins". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95 (15): 8514. Bibcode:1998PNAS...95.8514L. PMC 21107. PMID 9671709. doi:10.1073/pnas.95.15.8514. Consultado o 23 April 2014. 
  9. ↑ C, Franke; Grafe D; Bartsch H; Bachmann M (2009). "Use of non-radioactive detection method for north- and southwestern blot". Methods of Molecular Biology. Methods in Molecular Biology 536: 441–9. ISBN 978-1-934115-73-2. PMID 19378081. doi:10.1007/978-1-59745-542-8_44. 
  10. ↑ Schumacher, Jill; Keesook Lee; Susanne Edelhoff; Robert Braun (May 1995). "Spnr, a Murine RNA-binding Protein That Is Localized to Cytoplasmic Microtubules" (PDF). The Journal of Cell Biology 129 (4): 1023–1032. PMC 2120489. PMID 7744952. doi:10.1083/jcb.129.4.1023. Consultado o 7 May 2014. 
  11. ↑ Stohlman, S A; R S Baric; G N Nelson; L H Soe; L M Welter; R J Deans (1988). "Specific interaction between coronavirus leader RNA and nucleocapsid protein". Journal of Virology. 11 62 (11): 4288. Arquivado dende o orixinal (PDF) o 13 de setembro de 2019. Consultado o 25 March 2014. 
  12. ↑ Thangasamy, Saminathan. "Northwestern Blot of Protein-RNA Interaction from Young Rice Panicles". Consultado o 26 March 2014. 
  13. ↑ Perdew, Gary (Aug 17, 2008). Regulation of Gene Expression: Molecular Mechanisms. Springer. p. 129. ISBN 9781597452281. 
  14. ↑ Gary H. Perdew; Jack P. Vanden Heuvel; Jeffrey M. Peters (2008). Regulation of Gene Expression: Molecular Mechanisms. Springer. p. 129. ISBN 9781597452281. 
  15. ↑ 15,0 15,1 Smith, Christopher W.J. (1998). RNA-Protein Interactions : A Practical Approach: A Practical Approach. Oxford University Press. p. 187. ISBN 9780191591624. 
  16. ↑ Waldo, Cohen (Aug 16, 1991). Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. Academic Press. p. 186. ISBN 9780080863290. 
  17. ↑ Nicholson, Allen W. (2001). Ribonucleases, Part A: Functional Roles and Mechanisms of Action: Functional Roles and Mechanisms of Action. Academic Press. p. 409. ISBN 9780080496917. 

Véxase tamén

[editar | editar a fonte]

Outros artigos

[editar | editar a fonte]

Ligazóns externas

[editar | editar a fonte]
Protocolos