Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

Aparat do elektroforezy

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym[a], PAGE (od ang. polyacrylamide gel electrophoresis) – technika używana w biologii molekularnej do rozdzielania makromolekuł, przede wszystkim białek i kwasów nukleinowych.

Żel poliakrylamidowy jest popularny w biologii molekularnej ze względu na dobre właściwości optyczne, obojętność elektryczną (brak grup naładowanych elektrycznie), możliwość uzyskania różnego stopnia porowatości[1].

Żel powstaje w wyniku polimeryzacji akrylamidu i N,N′–metylenobisakrylamidu (bisakrylamidu), tworząc sieć elastycznych łańcuchów polimerowych, w którym migrują makromolekuły w polu elektrycznym. Polimeryzację tę katalizuje nadsiarczan amonu (APS) (lub nadsiarczan potasu) oraz N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiamina (TEMED) lub β-dimetyloaminopropionitryl (DMAP)[1][2].

Proces zestalenia zajmuje w temperaturze pokojowej około 30 minut, jednak uzyskanie kompletnego usieciowania wymaga ok. 12 godzin. Jest to reakcja egzotermiczna, która może zakłócać sieciowanie, dlatego ten etap zwykle przeprowadza się w warunkach chłodniczych. Polimeryzację hamuje obecność tlenu, dlatego żel zabezpiecza się wodą lub butanolem. Wielkość porów można regulować proporcją akrylamidu do bisakrylamidu[2]. Żele można przygotowywać jako płytowe lub też do stosowania w cienkich kolumnach w elektroforezie kapilarnej[3].

Rozdział białek

[edytuj | edytuj kod]
Żele po elektroforezie SDS-PAGE

Elektroforeza białek umożliwia ich uwidocznienie, zidentyfikowanie i scharakteryzowanie[4]. Możliwe jest dzięki niej szybkie oszacowanie ilości białek w mieszaninie lub stopnia oczyszczenia określonego białka w próbce[5].

Przygotowanie próbek

[edytuj | edytuj kod]
Umieszczanie próbek w studzienkach

W próbkach do elektroforezy należy uzyskać odpowiednie stężenia białek – zbyt niskie spowoduje trudności w wykryciu, zbyt wysokie może spowodować nachodzenie na siebie prążków. Stężenie to nie powinno być większe niż 1–10 µg na prążek[6].

Czasami konieczne jest usunięcie dużego stężenia soli z próbek ze względu na możliwe zakłócenia w analizie. Stosuje się w tym celu, między innymi, ultrafiltrację, precypitację, ekstrakcję do fazy stałej. Ponadto stosuje się detergenty do usuwania oddziaływań hydrofobowych sprzyjających agregacji i wytrącaniu białek[6].

Warunki redukujące usuwają mostki dwusiarczkowe w białkach, co prowadzi do ich rozfałdowania. Ułatwiony jest w ten sposób kontakt enzymów. Najczęściej stosuje się β-merkaptoetanol (BME), ditiotreitol (DTE), tributylofosfinę (TBP), (tris(2-karboksyetyl)fosfina) (TCEP). W celu zabezpieczenia przed ponownym tworzeniem się mostków stosować można jodoacetamid[6].

Przed umieszczeniem próbek w studzienkach zwykle dodaje się substancję obciążającą, przykładowo glicerynę, a także wprowadza barwnik (błękit bromofenolowy)[6].

Elektroforeza w warunkach natywnych

[edytuj | edytuj kod]

Elektroforeza w warunkach natywnych (bez denaturacji) pozwala zachować natywną konformację białka, interakcje podjednostek oraz aktywność biologiczną. Białka rozdzielane są w tym wypadku na podstawie stosunku ładunku do masy[7]. Bufor w dużej mierze decyduje o rozdzielczości rozdziału, a jego pH powinno być jak najbardziej zbliżone do punktu izoelektrycznego (pI) separowanych białek (inaczej może zajść denaturacja). Technika ma jednak wady w postaci stosunkowo małej rozdzielczości – trudno dobrać optymalne parametry równocześnie dla wszystkich białek[8]. Dodatkowo obecność interakcji między białkami sprawia, że taki rozdział nie jest do końca przewidywalny[9]

W rozdziale można polegać na ładunku własnym białka (ang. clear native PAGE), wtedy mogą migrować one w stronę jednej lub drugiej elektrody[9]. Można jednak do białek dodać barwnik błękit Coomassie (ang. blue native PAGE), który tworzy z białkami kompleksy anionowe, przez przy rozdziale będą one przemieszczały się w stronę anody[8].

Elektroforeza w warunkach denaturujących

[edytuj | edytuj kod]

Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) jest powszechnie stosowaną, szybką i łatwą techniką rozdziału białek charakteryzującą się dużą powtarzalnością. Po rozdziale można identyfikować białka za pomocą spektrometrii mas, western blottingu czy technik radiograficznych[8].

Obecność SDS, anionowego detergentu, nadaje wszystkim cząsteczkom jednolity ładunek ujemny, powoduje denaturację białek, dzięki czemu ładunek przestaje wywierać wpływ na różnice w tempie migracji[8]. Różnice w szybkości przemieszczania się białek zależą wtedy głównie od rozmiaru białka[9].

W rozdziale SDS-PAGE najczęściej stosuje się system Laemmliego[8]. Zakłada on występowanie żelu zagęszczającego (ang. stacking gel) o pH 6,8 i rozdzielającego (ang. resolving gel) o pH 8,8 i mniejszej porowatości. Żel zagęszczający ma skoncentrować białka w miejscu startu rozdziału, aby wszystkie zaczęły od tego samego punktu. W żelu rozdzielającym następuje rozdział według masy cząsteczkowej[10].

Aby uwidocznić białka na żelu, najczęściej stosuje się błękit Coomassie lub sole srebra. Rzadziej wykonuje się barwienie fluorescencyjne (głównie barwnikami z grupy SYPRO) czy znakowanie izotopowe[11].

Elektroforeza dwuwymiarowa

[edytuj | edytuj kod]
Żel z rozdzielonymi białkami po elektroforezie dwuwymiarowej. Na osi X rozdział względem pI, na osi Y względem masy cząsteczkowej

Elektroforeza dwuwymiarowa (dwukierunkowa) (2-DE) umożliwia rozdział białek zarówno ze względu na ich wielkość, jak i ładunek[5]. Elektroforeza dwukierunkowa może służyć do rozdzielania skomplikowanych mieszanin białek[12], dzięki niej można rozdzielić ponad 1000 białek do postaci dwuwymiarowej mapy[13].

W pierwszym etapie białka rozdzielane są na podstawie ich punktu izoelektrycznego przy użyciu techniki ogniskowania izoelektrycznego. Wypadkowy ładunek białka zależny jest od ładunków aminokwasów wchodzących w jego skład. Ze względu na amfoteryczność białek ładunek końcowy zależy od pH roztworu, w którym się znajdują (w pH powyżej pI białko ma ujemny ładunek wypadkowy i wędruje w kierunku anody; w pH poniżej pI ma dodatni ładunek i migruje w stronę katody). Ładunek wypadkowy nie zależy od wielkości białek. Białko migruje w gradiencie pH do miejsca, w którym pH równe jest jego pI. W miejscu tym białko traci ładunek i staje się nieruchome (ogniskuje)[5]. W drugim etapie białka poddaje się rozdziałowi metodą SDS-PAGE w kierunku prostopadłym do użytego w etapie pierwszym[13].

Do zalet elektroforezy dwukierunkowej należy możliwość obserwacji np. modyfikacji potranslacyjnych, częściowej proteolizy, poziomu ekspresji białek. Do wad należy czasochłonność, brak pełnej automatyzacji, mała powtarzalność i nie zawsze zadowalająca rozdzielczość. Technika ta jest jednak stale ulepszana[14].

Rozdział kwasów nukleinowych

[edytuj | edytuj kod]

W rozdziale kwasów nukleinowych najczęściej używanymi żelami w elektroforezie jest żel agarozowy i poliakrylamidowy[15]. DNA naładowany jest ujemnie i migruje w stronę elektrody dodatniej[16]. Elektroforezę przeprowadza się do czasu aż marker (zwykle błękit bromofenolowy) przemieści się na drugi koniec żelu[15]. DNA zostaje rozdzielone według wielkości cząsteczek w związku z tym, że większe cząsteczki migrują wolniej od mniejszych. Wpływ ma też kształt i właściwości topologiczne)[16]. Kwasy nukleinowe można potem zwizualizować przez dodatek bromku etydyny, który interkaluje między nukleotydami. Obraz w postaci pomarańczowych prążków można uzyskać w świetle UV[15].

Żele poliakrylamidowe do rozdziału kwasów nukleinowych zawierają także mocznik o właściwościach denaturujących. Zapobiega to wewnętrznemu parowaniu zasad w kwasach, które mogłyby wytworzyć drugorzędowe struktury. Takie zmiany konformacji mogłyby wpłynąć na tempo migracji cząsteczek, uniezależniając je ściśle od długości (rozmiaru)[3].

Elektroforezę w żelu poliakrylamidowym do rozdziału kwasów nukleotydowych stosuje się, kiedy potrzebna jest duża rozdzielczość. Żele agarozowe mają większe pory i rozdział cząsteczek o wielkości poniżej 1500 pz staje się mniej dokładny[3]. O ile 0,7% żel agarozowy jest w stanie rozdzielić cząsteczki kwasów nukleinowych o wielkości 300–20 000 pz, tak 10% żel poliakrylamidowy rozdziela cząsteczki o wielkości 25–500 pz, a 20% żel nawet 1–50 pz[15].

Żele poliakrylamidowe stosuje się podczas sekwencjonowania DNA metodą terminacji łańcucha, gdy rozdzielane cząsteczki kwasów nukleinowych różnią się między sobą o pojedyncze nukleotydy[3].

Uwagi

[edytuj | edytuj kod]
  1. ↑ także: elektroforeza w żelu poliakryloamidowym

Przypisy

[edytuj | edytuj kod]
  1. ↑ a b Righetti P. G.: Polyacrylamide Gels. W: Reedijk J.: Reference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical Engineering. Elsevier, 2005, s. 396–407. DOI: 10.1016/B0-12-369397-7/00122-9. ISBN 978-0-12-409547-2.
  2. ↑ a b Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 50–51.
  3. ↑ a b c d T. A. Brown: Genomy. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2013, s. 104–105. ISBN 978-83-01-15634-3.
  4. ↑ Faoro V., Becker K. F., Stanta G.: One-Dimensional Sodium-Dodecyl-Sulfate (SDS) Polyacrylamide Gel Electrophoresis. W: Stanta G.: Guidelines for Molecular Analysis in Archive Tissues. Springer, 2011, s. 261–262. DOI: 10.1007/978-3-642-17890-0. ISBN 978-3-642-17889-4.
  5. ↑ a b c L. A. Allison: Podstawy Biologii Molekularnej. Warszawa: Wydawnictwa Uniwersytetu Warszawskiego, 2007, s. 252–253. ISBN 978-83-235-0527-3.
  6. ↑ a b c d Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 52–53.
  7. ↑ Protein Gel Electrophoresis Technical Handbook. ThermoFisher, 2015. [dostęp 2017-10-19]. (ang.).
  8. ↑ a b c d e Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 53–54.
  9. ↑ a b c A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bio-Rad. [dostęp 2017-10-18]. (ang.).
  10. ↑ Wu X., Koiwa H.. One-step casting of Laemmli discontinued sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis gel. „Biologia Plantarum”. 55 (1), s. 1–15, 2011. DOI: 10.1007/s10535-011-0001-2. 
  11. ↑ Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 54–57.
  12. ↑ Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 61–62.
  13. ↑ a b Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P.: Podstawy Biologii Komórki cz. 1. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2016, s. 162–163. ISBN 978-83-01-14468-5.
  14. ↑ Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 67.
  15. ↑ a b c d D. S. T. Nicholl: An Introduction to Genetic Engineering. Warszawa: Cambridge University Press, 2008, s. 40–41. ISBN 978-0-521-85006-3.
  16. ↑ a b Watson J. D., Baker T. A., Bell S. P., Gann A., Levine M., Losick R.: Molecular Biology of the Gene. Pearson Education, 2004, s. 648–649. ISBN 0-321-22368-3.

Bibliografia

[edytuj | edytuj kod]
  • A. Kraj, A. Drabik, J. Silberring: Proteomika i Metabolika. Warszawa: Wydawnictwa Uniwersytetu Warszawskiego, 2010. ISBN 978-83-235-0765-9.