Método TUNEL

Fígado de camundongo com célula apoptótica marcada por TUNEL

O método de marcação de "nicks" por dUTP e deoxinucleotidil terminal transferase (do inglês, Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) ) é um método para detecção de fragmentação de DNA através da marcação da ponta terminal de ácidos nucleicos.[1]

Método

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O método de TUNEL é utilizado normalmente para detectar a fragmentação do DNA resultante de cascatas de sinalização apoptóticas.[1] O ensaio se baseia na presençã de "nicks" (cortes simples fita) no DNA, identificados pela enzima deoxinucleotidil terminal transferase(terminal deoxynucleotidyl transferase ou TdT). Essa enzima catalisa a adição de dUTPs, marcados com um marcados secundario. Ele pode marcar células que tenham sofrido também dano severo ao DNA (mesmo não sendo fruto direto da cascata apoptótica)

História

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Descrito originalmente por Gavrieli, Sherman e Ben-Sasson em 1992,[2]  o método de TUNEL se tornou um dos principais métodos para detectar morte programada por apoptose. Contudo, há um debate sobre sua acurácia, devido a marcação inapropriada no ensaio original de células necróticas como apoptóticas .[3] O método foi aperfeiçoado posteriormentie e, caso executado corretamente, deve identificar unicamente células na última fase da apoptose.[4][5] Novos métodos incorporam dUTPS modificados com fluoróforos ou pequenas moléculas, como biotina e bromina, que podem ser detectados diretamente com núcleotídeos modificados com fluorescência (dUDP-fluoresceína) ou indiratamente com streptavidina ou anticorpos marcados, caso dUTP biotinilado ou BrdUTP são usados, respectivamente.

Referências

  1. ↑ a b Lozano G.M., Bejarano, I., Espino, J., González, D., Ortiz, A., García, J.F., Rodríguez, A.B., Pariente, J.A. (2009).
  2. ↑ Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA (1992). «Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation». J Cell Biol. 119 (3): 493–501. PMC 2289665Acessível livremente. PMID 1400587. doi:10.1083/jcb.119.3.493 
  3. ↑ Grasl-Kraupp B, Ruttkay-Nedecky B, Koudelka H, Bukowska K, Bursch W, Schulte-Hermann R (1995). «In situ detection of fragmented DNA (TUNEL assay) fails to discriminate among apoptosis, necrosis, and autolytic cell death: a cautionary note». Hepatology. 21 (5): 1465–8. PMID 7737654. doi:10.1002/hep.1840210534 
  4. ↑ Negoescu A, Lorimier P, Labat-Moleur F, Drouet C, Robert C, Guillermet C, Brambilla C, Brambilla E (1996). «In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations». J Histochem Cytochem. 44 (9): 959–68. PMID 8773561. doi:10.1177/44.9.8773561 
  5. ↑ Negoescu A, Guillermet C, Lorimier P, Brambilla E, Labat-Moleur F (1998). «Importance of DNA fragmentation in apoptosis with regard to TUNEL specificity». Biomed Pharmacother. 52 (6): 252–8. PMID 9755824. doi:10.1016/S0753-3322(98)80010-3 

Ligações externas

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