Норсвестерн-блот

Типові результати.

Норсвестерн-блот — це експериментальна техніка в молекулярній біології, що певною мірою є комбінацією вестерн-блоту та нозерн-блоту; в результаті норсвестерн-блот експерименту можливо виявити взаємодії між РНК та білками. Споріднена техніка, вестерн-блот, використовується для виявлення окремих білків у складних сумішах за допомогою розділення гель-електрофорезом, переносом продуктів розділення на нітроцелюлозну мембрану та обробку мембрани специфічним антитілом з барвником для детекції. Інша споріднена техніка, нозерн-блот, використовується для виявлення РНК; при цьому комплементарні гибридизаційні олігонуклеотиди-зонди використовуються замість антитіл для обробки мембрани з продуктами електрофоретичного розділення. Норсвестерн-блот поєднує в собі елементи вестрен-блоту та нозерн-блоту, що дозволяє специфічно виявляти РНК-білкові взаємодії.

Історія

[ред. | ред. код]
Сер Едвін Саузерн (2012 рік)

Едвіном Саузерном було створено експериментальну методику, що дістала назву саузерн-блот,[1] яка дозволяла детекцію молекул ДНК у сумішах. Після розділення молекул ДНК у суміші за допомогою гель-електрофорезу, продукти розділення переносились на спеціальну мембрану; після цього мембрана оброблялась ізотопно-міченим олігонуклеотид-зондом комплементарним до послідовності, яку потрібно детектувати.[1]  Поява радіоактивних ділянок на мембрані сигналізує про наявність в ній цільової послідовності ДНК.[2] Дуже швидко ця методика була адаптована для детекції інших біомолекул. Результатом стало виникнення вестерн-блоту (детекція білків), нозерн-блоту (детекція РНК), саузернвестерн-блоту (детекція ДНК-білкових взаємодій), істерн-блоту (детекція посттрансляційних модифікацій в білках) та власне норсвестерн-блоту (детекція РНК-білкових взаємодій).[3][4][5][6]

Особливості техніки

[ред. | ред. код]

Першим етапом норсвестерн-блоту є розділення РНК-зв'язуючих білків за допомогою електрофорезу.[5] Після цього розділені відповідно до заряду та молекулярної маси білки переносяться на нітроцелюлозну мембрану.[7]

Далі, мембрана обробляються протеїн-вмісним блокуючим розчином, щоб уникнути неспецифічного зв'язування антитіл з мембраною.[8] Після блокування, розчин певної конкурентної міченої РНК додається до мембрани та інкубується, що призводить до зв'язування РНК із відповідними РНК-зв'язуючими білками, якщо вони присутні на мембрані. Час інкубації залежить від концентрацій РНК та білку та константи дисоціації комплексу; типовий час інкубації складає приблизно одну годину.[9] Після цього надлишок РНК відмивається (фосфатний буфер)[10] а потім радіоактивна РНК, що зв'язалась з РНК-зв'язуючими білками, детектується за допомогою ауторадіографії.[11]

Практичне застосування

[ред. | ред. код]

Цей метод дає змогу швидко визначити наявність, молекулярну масу та відносну кількість РНК-зв'язуючих білків.[12] Цей метод може бути поєднаний з вестерн-блотом, щоб отримати додаткову інформацію щодо ідентичності окремих білків.

Переваги та недоліки

[ред. | ред. код]

Перевагою норсвестерн-блоту є можливість відносно швидко визначити кількість білків, які зв'язуються з певною послідовністю РНК.[13] Він як правило є першим кроком в аналізі РНК-білкових взаємодій та дає первинну інформацію, яка необхідна для подальшого вивчення конкретних білків. 

Недоліком методу є те, що певні РНК-білкові комплекси з малою константою асоціації не можуть бути ідентифіковані.[13]  Використання неоптимальних умов провдення окремих стадій призводить до низького відношення сигнал/шум, що також ускладнює інтерпретацію результатів. Окрім цього, необоротна денатурація білків також може призводити до неможливості ідентифікації їх РНК-зв'язуючих властивостей. Неможливим також є вивчення РНК-білкових комплексів, що включають декілька білкових субодиниць.[14]

Див. також

[ред. | ред. код]

Посилання

[ред. | ред. код]
  1. ↑ а б Southern, Edwin Mellor (5 листопада 1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology. Т. 98, № 3. с. 503—517. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0. ISSN 0022-2836. PMID 1195397.
  2. ↑ Nelson, Cox (2013). Lehninger Principles of Biochemistry. New York, NY: W.H. Freeman and Company. с. 179. ISBN 978-1-4641-0962-1.
  3. ↑ Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008.
  4. ↑ Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. (1997) An Improved, Rapid Northern Protocol.
  5. ↑ а б Rapley, R (2000). The Nucleic Acid Protocols Handbook. Totowa, NJ: Humana Press Inc. с. 783. ISBN 0-89603-459-3.
  6. ↑ Nicholas; Nelson (2013). North, South, or East? Blotting Techniques. Journal of Investigative Dermatology. Т. 133, № e10. с. e10. doi:10.1038/jid.2013.216. Архів оригіналу за 20 січня 2016. Процитовано 28 березня 2016.
  7. ↑ Verena, Bichsel; Alfred Walz; Matthias Bickel (1997). Identification of proteins binding specifically to the 3'-untranslated region of granulocyte/macrophage-colony stimulating factro mRNA (PDF). Nucleic Acids Research. Т. 25, № 12. с. 2417—2423. doi:10.1093/nar/25.12.2417. PMID 9171094. Процитовано 7 травня 2014.
  8. ↑ Liao, Huey-Jane; Ryuji Kobyashi and Michael B. Matthews; Mathews, M. B. (21 липня 1998). Activities of adenovirus virus-associated RNAs: Purification and characterization of RNA binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Т. 95, № 15. с. 8514. Bibcode:1998PNAS...95.8514L. doi:10.1073/pnas.95.15.8514. PMID 9671709. Архів оригіналу за 24 вересня 2015. Процитовано 23 квітня 2014.
  9. ↑ C, Franke; Grafe D; Bartsch H; Bachmann M (2009). Use of non-radioactive detection method for north- and southwestern blot. Methods of Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. Т. 536. с. 441—9. doi:10.1007/978-1-59745-542-8_44. ISBN 978-1-934115-73-2. PMID 19378081.
  10. ↑ Schumacher, Jill; Keesook Lee; Susanne Edelhoff; Robert Braun (May 1995). Spnr, a Murine RNA-binding Protein That Is Localized to Cytoplasmic Microtubules (PDF). The Journal of Cell Biology. Т. 129, № 4. с. 1023—1032. doi:10.1083/jcb.129.4.1023. PMC 2120489. PMID 7744952. Архів оригіналу (PDF) за 13 вересня 2019. Процитовано 7 травня 2014.
  11. ↑ Stohlman, S A; R S Baric; G N Nelson; L H Soe; L M Welter; R J Deans (1988). Specific interaction between coronavirus leader RNA and nucleocapsid protein. Journal of Virology. 11. Т. 62, № 11. с. 4288. Архів оригіналу за 13 вересня 2019. Процитовано 25 березня 2014.
  12. ↑ Thangasamy, Saminathan. Northwestern Blot of Protein-RNA Interaction from Young Rice Panicles. Архів оригіналу за 26 березня 2014. Процитовано 26 березня 2014.
  13. ↑ а б Smith, Christopher W.J. (1998). RNA-Protein Interactions : A Practical Approach: A Practical Approach. Oxford University Press. с. 187. ISBN 9780191591624.
  14. ↑ Nicholson, Allen W. (2001). Ribonucleases, Part A: Functional Roles and Mechanisms of Action: Functional Roles and Mechanisms of Action. Academic Press. с. 409. ISBN 9780080496917.