Otto Behaghel war der Sohn des Oberkirchenrats Felix Behaghel (1822–1888) und seiner Frau Pauline, geborene Wielandt (1827–1901).
Er besuchte die Vorschule sowie das Gymnasium in Karlsruhe und absolvierte 1872/73 seinen Militärdienst in einem badischen Regiment, wo er als Leutnant der Reserve entlassen wurde. Anschließend studierte er von 1873 bis 1876 an den Universitäten Heidelberg, Göttingen und Paris, wobei besonders Karl Bartsch einen wesentlichen Einfluss auf den jungen Studenten ausübte.
Am 22. April 1876 promovierte er in Heidelberg mit dem Thema Die Modi im Heliand, ein Versuch auf dem Gebiete der Syntax zum Doktor der Philosophie. 1877 absolvierte er sein philosophisches Staatsexamen und 1878 habilitierte er sich als Privatdozent für germanische und romanische Philologie mit dem Thema Die Zeitfolge der abhängigen Rede im Deutschen in Heidelberg. Hier gründete er mit Fritz Neumann 1880 das Literaturblatt für Germanische und Romanische Philologie, und 1882 wurde er an der Universität Heidelberg außerordentlicher Professor.
Am 9. Juni 1883 wurde er ordentlicher Professor der deutschen Philologie an der Universität Basel und am 30. Juni 1888 Professor für Germanistik an der Universität Gießen. Dort beteiligte er sich auch an organisatorischen Aufgaben und war 1895, 1905 sowie 1907 Rektor der Alma Mater.
Am 2. August 1887 heiratete Otto Behaghel Klara Elisabeth Maria Dorothea Zöller (1866–1924), eine Tochter des Chemikers Philipp Zöller. Aus der Ehe sind die Tochter Elisabeth (* 5. Februar 1890 in Gießen; † 1967) und der Sohn Otto Behaghel (* 25. August 1895 in Gießen; † 16. Februar 1961 ebenda) bekannt. Otto Behaghel war außerordentlicher Professor der Chemie an der Universität Gießen.
Karl-Heinz Best: Otto Behaghel (1854–1936). In: Glottometrics. 14, 2007, S. 80–86 (PDF Volltext). (Wiederabdruck in: Karl-Heinz Best (Hrsg.): Studien zur Geschichte der Quantitativen Linguistik. Band 1. RAM-Verlag, Lüdenscheid 2015, S. 14–20. ISBN 978-3-942303-30-9.)
Wolfgang Georg Bayerer: Findbuch zum Nachlass Otto Behaghel (1854–1936). (= Berichte und Arbeiten aus der Universitätsbibliothek und dem Universitätsarchiv Gießen; 45/1993). Universitätsbibliothek Gießen, Gießen 1993 (Digitalisat), (PDF)
Hannelore Götz, Klaus-Dieter Rack: Hessische Abgeordnete 1820–1933. Ergänzungsband: Biographische Nachweise für die Erste Kammer der Landstände des Großherzogtums Hessen. (Darmstädter Archivschriften 10), Darmstadt 1995, S. 39.
Herman Haupt, Georg Lehnert: Chronik der Universität Gießen, 1607–1907. Alfred Tölpelmann, Gießen, 1907, S. [53] (Digitalisat).
Jochen Lengemann: MdL Hessen. 1808–1996. Biographischer Index (= Politische und parlamentarische Geschichte des Landes Hessen. Bd. 14 = Veröffentlichungen der Historischen Kommission für Hessen. Bd. 48, 7). Elwert, Marburg 1996, ISBN 3-7708-1071-6, S. 68.
Klaus-Dieter Rack, Bernd Vielsmeier: Hessische Abgeordnete 1820–1933. Biografische Nachweise für die Erste und Zweite Kammer der Landstände des Großherzogtums Hessen 1820–1918 und den Landtag des Volksstaats Hessen 1919–1933 (= Politische und parlamentarische Geschichte des Landes Hessen. Bd. 19 = Arbeiten der Hessischen Historischen Kommission. NF Bd. 29). Hessische Historische Kommission, Darmstadt 2008, ISBN 978-3-88443-052-1, S. 152.
↑Holger Krahnke: Die Mitglieder der Akademie der Wissenschaften zu Göttingen 1751–2001 (= Abhandlungen der Akademie der Wissenschaften zu Göttingen, Philologisch-Historische Klasse. Folge 3, Bd. 246 = Abhandlungen der Akademie der Wissenschaften in Göttingen, Mathematisch-Physikalische Klasse. Folge 3, Bd. 50). Vandenhoeck & Ruprecht, Göttingen 2001, ISBN 3-525-82516-1, S. 34.
↑M. Göbel, A. Kiock, Richard Eckert (Hrsg.): Verzeichnis der Alten Herren und Ehrenmitglieder des Naumburger Kartell-Verbandes Klassisch-Philologischer Vereine an deutschen Hochschulen, A. Favorke, Breslau 1913, S. 58.