Etidio bromuro

Etidio bromuro
Formula kimikoaC21H20BrN3
SMILES kanonikoa2D eredua
MolView3D eredua
KonposizioaNitrogeno, karbono, bromo eta hidrogeno
Motakonposatu kimiko
Ezaugarriak
Fusio-puntua248,5 °C
Masa molekularra393,08406 Da
Erabilera
RolaEntzimen inhibitzaile, fluorophore (en) Itzuli, trypanocidal agent (en) Itzuli, nicotinic antagonist (en) Itzuli eta Bakterizida
Arriskuak
NFPA 704
1
4
0
Identifikatzaileak
InChlKeyZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N
CAS zenbakia1239-45-8
ChemSpider14034
PubChem14710 eta 53630235
Reaxys3642536
Gmelin4883
ChEMBLCHEMBL284328
RTECS zenbakiaSF7950000
ZVG109233
DSSTox zenbakiaSF7950000
EC zenbakia214-984-6
ECHA100.013.622
MeSHD004996
UNII059NUO2Z1L
KEGGC11161
Etidio bromuroaren egitura kimikoa.

Etidio bromuroa (EtBr) agente tartekatzaile bat da, biologia molekularreko laborategietan erabiltzen dena agarosa gel elektroforesia bezalako tekniketan markatzaile fluoresente (azido nukleiko tartekatzaile) moduan. EtBr bezala laburbildu daiteke, zein aldi berean bromoetanoaren laburdura den, baina laborategi batzuetan EthBr bezala erabili ohi da nahasteak ekiditeko. Argi ultramorearen eraginpean laranja koloreko fluorespena eragiten du, fluoreszentzia hori ia 20 aldiz areagotzen da DNAri lotu ondoren. Etidio bromuroa DNAn tartekatzen denez, efektu mutagenoa eta kartzinogenoa edo teratogenoa eduki dezakeen ideia dago, baina nahiko segurua dela frogatu da.[1] Gaur egun, badaude beste konposatu batzuk etidio bromuroaren funtzioa betetzen dutenak eta seguruago bezala saltzen direnak, efektu mutagenorik ez dutelako; adibidez, Sybr Safe (Invitrogen), Gel Red (Biotium) edo MIDORI green (Nippon Genetics).

Etidio bromuroaren kristal-egitura bola eta makilen eredua erabiliz.

Etidio bromuroak CAS1239-45-8 erreferentzia du eta formula kimikoa da. Konposatu fluoreszente gehienak bezala, substantzia aromatikoa da. Molekularen zati handiena egitura trizikliko bat da, piridina molekula baten alde bakoitzean amino-bentzeno taldeak dituena (sei atomo, nitrogenoa eta eraztun aromatikoa). Dibenzopiridina egitura hori fenantridina izenarekin ezagutzen da.

Egitura, kimika eta fluoreszentzia

[aldatu | aldatu iturburu kodea]

Konposatu fluoreszente gehienak bezala, etidio bromuroa aromatikoa da. Bere oinarrizko zati heteroziklikoa fenantridina moduan ezagutzen da, eta horren isomero bat akridina koloratzaile fluoreszentea da. EtBr molekularen xurgapen maximoak ur-disoluzioan 210 nm eta 285 nm artekoak dira, argi ultramoreari dagozkienak. Kitzikapen horren ondorioz, EtBr-ak 605 nm-ko uhin-luzera duen argi laranja igortzen du.[2][3]

Etidio bromuroaren kristal-egitura espazioa betetzeko eredua erabiliz.

Etidio bromuroaren fluoreszentzia DNArekin lotu ondoren ziurrenik ez dagokio fenil zatiaren egonkortze zurrunari, fenilo-eraztunak tartekatutako baseetatik kanpo proiektatzen direla frogatu baita. Horren ordez, arrazoia base pareen artean aurkitutako ingurune hidrofoboa dela uste da. Ingurune hidrofobo horretara mugitzean eta disolbatzailetik urruntzean, etidio katioiak lotuta dituen ur-molekulak askatzen ditu. Ura fluoreszentziaren itzaltzaile eraginkorra denez, ur molekula horiek kentzean etidioak fluoreszentzia igortzen du.

Aplikazioak

[aldatu | aldatu iturburu kodea]
DNA lagina azido nukleikoen gel elektroforesiaren bidez banandu eta etidio bromuroarekin tindatuta, argi laranja igortzen duena DNArekin lotu ondoren.

Biologia molekularreko laborategietan azido nukleikoak detektatzeko erabiltzen da etidio bromuroa. DNAren kasuan, helize bikoitzekoa izan ohi da. Bestalde, RNA ere detektatu daiteke, izan ere, bere buruarekin tolesten da eta base parekaketak sortzen diren guneetan molekula tartekatzen da. Detekzioetan normalean azido nukleikoak dituzten gelak erabiltzen dira lanpara ultramore batekin argiztatuta. Argi ultramorea begietarako eta azalerako kaltegarria denez, etidio bromuroa daukaten gelak zeharka ikusten dira, itxitako ganbara baten bidez. Zuzenean ikusi behar den kasuan, ikuslearen begiak eta agerian dagoen azala babestu behar dira.

Etidio bromuroa agarosa gel elektroforesiaren bidez DNA zatiak bereizteko ere erabiltzen da.[4] Tanpoi migratzaileari gehitzen zaio eta DNA base-bikoteen artean tartekatzen da. Agarosa gela argi ultramorearekin argiztatzen denean, DNA-bandak ikusten dira. EtBr-aren arteko tartekatzeak DNA molekulen propietateak alda ditzake, hala nola, karga, pisua, konformazioa eta malgutasuna. Agarosa gelaren zehar DNA molekularen mugikortasuna pisu molekularraren araberakoa denez, EtBr-aren efektuak erabakigarriak izan daitezke molekulen tamainak zehazterako orduan.[5]

Etidio bromuroa ere asko erabili da ugaltzen ari diren zeluletan DNA mitokondrialaren kopia kopurua murrizteko.[6] EtBr-ek DNA mitokondrialean duen eragina albaitaritzan behien tripanosomiasia tratatzeko erabiltzen da, EtBr-ak kinetoplastidoen DNA molekulak lotzen eta horien konformazioa Z-DNA formara aldatzen baitu. Forma horren ondorioz, kinetoplastido DNAren erreplikazioa oztopatzen da, tripanosomentzat hilgarria dena.[7]

Amaitzeko, etidio bromuroa YEPD meditoetara gehitu daiteke zelulen hazkuntzaren inhibitzaile gisa erabiltzeko.[8]

Gelaren alternatibak

[aldatu | aldatu iturburu kodea]

Badira etidio bromuroaren alternatibak arrisku gutxiago eta errendimendu hobea daukatela iragartzen dutenak.[9] [10]Esaterako, ikertzaile batzuek SYBRn oinarritutako hainbat koloratzaile erabiltzen dituzte eta beste koloratzaile batzuk sortzen ari dira, hala nola "Novel Juice". SYBR koloratzaileak ez dira EtBr bezain mutagenikoak, gibel-erauzkinarekin egindako Ames probaren arabera.[11] Hala ere, UV azpian ikusgai (koloratzaile biak ikusteko erabiltzen da) zeuden bakterio-zelulentzako SYBR Green I EtBr baino mutagenikoagoa zela ikusi zen.[12]

SYBR Safe-ren MSDSak arratoientzako LD50 5 g/kg baino gehiagoko balio baten berri ematen du, zein EtBr-arena baino handiagoa (1,5 g/kg) den. Tindaketa helburuetarako EtBr-ren ordez SYBR koloratzaileak erabiltzeak etekinean abantaila duen arren, ikertzaile askok oraindik EtBr nahiago dute, askoz merkeagoa baita.

Arriskuak

[aldatu | aldatu iturburu kodea]

Etidio bromuroak osasun-arrisku larriak eragiten ditu, mutageno gisa jokatzen du kate bikoitzeko DNAn tartekatzen delako, hau da, kateen artean txertatu eta DNA deformatuz.[13][1] Ugaztunetan zein bakterioen zeluletan mutagenikotasuna erakusten duten proba ugari izan arren, animalia bizietan epe luzerako probarik ez izatea[1] arriskutsua ez dela argudiatzeko arrazoi bezala erabili da. Hala ere, ikerketa laborategi modernoek normalean produktu kimiko arriskutsu gisa tratatzen dute.[14] 1975ean, etidio bromuroa bakterioentzako mutagenoa zela aurkitu zen (Ames probaren bidez), eta DNAn toxikotasuna ere eragin zuen gibel-homogeneizatuaren tratamenduaren ondoren.[15] 1994an, Toxikologia Programa Nazionalak in vivo (biziak) arratoi, sagu eta hamster zeluletan EtBr konposatuak mutagenikotasun handia erakusten zituen ikerketak ere aurkitu zituen. Azterketek ondorioztatu zuten EtBr genotoxikoa zela.[16] Kartzinogenizitateari dagokionez, saguetan egindako ikerketa batek etidio bromuroa erabili zuen p53 genean alterazioak detektatzeko eta minbizia hautemateko. Etidio bromuroaren bidez p53 genean mutazioak induzitzen saiatu ziren, baina zelulak oso mutatuta egon arren, p53 genean ez zen mutaziorik aurkitu.[17]

Etidio Bromuroaren mutagenikotasun handia dela eta, azterketa bat egin zen saguetan EtBr-a agente kimioterapeutiko antitumoral gisa ebaluatzeko.[18] Bertan, etidio bromuroa gizakien eta saguen mitokondrioentzako oso mutagenoa zela ikusi zen.[19] Ikerketa berriago batek erakusten du EtBr-ek topoisomerasa I-entzat pozoi gisa jokatzen duela eta giza DNA mutatzen duela. Ezaugarri hori dela eta, minbiziaren aurkako botiken ikerketarako oinarri gisa erabiltzea proposatu da, baina oraindik ez da etidio bromuroa erabiltzen duten botikarik garatu.[20] Horrela, badira konposatuaren toxikotasuna zalantzan jarri duten iruzkintzaileak.[1][21]

Etidio bromuroaren erabilera gehiena laborategian (0,25-1 µg/ml) LD50 dosiaren azpitik dago. Gizakietan probak egitea eta edozein ugaztun-sistematan azterketa luzeagoak egin beharko lirateke epe luzerako etidio bromuroak laborategiko langileentzat duen arriskua guztiz ulertzeko, baina argi dago etidio bromuroak ugaztun zein bakterio zelulak erabat mutatzen eta hiltzen dituela.[22]

Isurketak

[aldatu | aldatu iturburu kodea]

Etidio bromuroa kontzentrazio baxuetan ez dago hondakin arriskutsu gisa erregulatuta,[23] baina erakunde askok hondakin arriskutsu gisa tratatzen dute. Materiala materialen segurtasun-datuen fitxaren (MSDS) arabera maneiatu behar da.

Laborategiko etidio bromuroa botatzea gai polemiko bat da oraindik.[24] Etidio bromuroa kimikoki degradatu daiteke, edo bildu eta erraustu. Ohikoa da agindutako kontzentraziotik beherako etidio bromuroaren hondakinak modu normalean botatzea (esate baterako, hustubide batera botatzea). Beste ohiko praktika bat etidio bromuroa sodio hipokloritoarekin (lixibarekin) tratatzea da, eta ondoren botatzea.[25]

Erreferentziak

[aldatu | aldatu iturburu kodea]
  1. ↑ a b c d (Ingelesez) «The Myth of Ethidium Bromide» www.science.org (Noiz kontsultatua: 2022-02-27).
  2. ↑ Sabnis, R. W.. (2010). Handbook of Biological Dyes and Stains : Synthesis and Industrial Applications.. John Wiley & Sons ISBN 978-0-470-58623-5. PMC 609862702. (Noiz kontsultatua: 2022-03-04).
  3. ↑ "Aplication Note: Ethidium Bromide" (PDF) 2014ko apirilaren 6an berreskuratua
  4. ↑ Borst, Piet. (2005-11-01). «Ethidium DNA agarose gel electrophoresis: How it started» IUBMB Life (International Union of Biochemistry and Molecular Biology: Life) 57 (11): 745–747.  doi:10.1080/15216540500380855. ISSN 1521-6543. (Noiz kontsultatua: 2022-03-29).
  5. ↑ Sigmon, Janie; Larcom, Lyndon L.. (1996). «The effect of ethidium bromide on mobility of DNA fragments in agarose gel electrophoresis» Electrophoresis 17 (10): 1524–1527.  doi:10.1002/elps.1150171003. ISSN 0173-0835. (Noiz kontsultatua: 2022-03-29).
  6. ↑ Diaz, Francisca; Bayona-Bafaluy, Maria Pilar; Rana, Michele; Mora, Marialejandra; Hao, Huiling; Moraes, Carlos T.. (2002-11-01). «Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control» Nucleic Acids Research 30 (21): 4626–4633.  doi:10.1093/nar/gkf602. ISSN 1362-4962. PMID 12409452. (Noiz kontsultatua: 2022-03-29).
  7. ↑ Roy Chowdhury, Arnab; Bakshi, Rahul; Wang, Jianyang; Yildirir, Gokben; Liu, Beiyu; Pappas-Brown, Valeria; Tolun, Gökhan; Griffith, Jack D. et al.. (2010-12-16). «The Killing of African Trypanosomes by Ethidium Bromide» PLoS Pathogens 6 (12): e1001226.  doi:10.1371/journal.ppat.1001226. ISSN 1553-7366. PMID 21187912. PMC 3002999. (Noiz kontsultatua: 2022-03-29).
  8. ↑ (Ingelesez) Caesar, Robert; Warringer, Jonas; Blomberg, Anders. (2006-02). «Physiological Importance and Identification of Novel Targets for the N-Terminal Acetyltransferase NatB» Eukaryotic Cell 5 (2): 368–378.  doi:10.1128/EC.5.2.368-378.2006. ISSN 1535-9778. PMID 16467477. PMC PMC1405896. (Noiz kontsultatua: 2022-03-29).
  9. ↑ Huang, Qing; Fu, Wei-Ling. (2005-01-01). «Comparative analysis of the DNA staining efficiencies of different fluorescent dyes in preparative agarose gel electrophoresis» Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM) 43 (8)  doi:10.1515/CCLM.2005.141. ISSN 1434-6621. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  10. ↑ «Safer stains for DNA» bioscience-explained.org (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  11. ↑ (Ingelesez) Singer, Victoria L; Lawlor, Timothy E; Yue, Stephen. (1999-02). «Comparison of SYBR® Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test)» Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 439 (1): 37–47.  doi:10.1016/S1383-5718(98)00172-7. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  12. ↑ (Ingelesez) Ohta, Toshihiro; Tokishita, Shin-ichi; Yamagata, Hideo. (2001-05). «Ethidium bromide and SYBR Green I enhance the genotoxicity of UV-irradiation and chemical mutagens in E. coli» Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 492 (1-2): 91–97.  doi:10.1016/S1383-5718(01)00155-3. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  13. ↑ (Ingelesez) Waring, M.J.. (1965-08). «Complex formation between ethidium bromide and nucleic acids» Journal of Molecular Biology 13 (1): 269–282.  doi:10.1016/S0022-2836(65)80096-1. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  14. ↑ University of Iowa. "Environmental Health and Safety"
  15. ↑ McCann, J.; Ames, B.N. (1975). "Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals". Proceedings of the National Academy of Sciences. 72 (12): 5135-5139. Bibcode:1975PNAS...72.5135M. doi:10.1073/pnas.72.12.5135. PMC 388891. PMID 1061098.
  16. ↑ "Ethidium Bromide: Genetic Toxicity". National Toxicology Program. 2005-08-15.
  17. ↑ Marossek, Virginia. «Identifizierung und Charakterisierungmolekularbiologischer Veränderungen am Beispiel des Tumorsuppressors p53in der Tamoxifen- bzw. Bromdeoxyuridin-induzierten Karzinogenese imLabornager» docserv.uni-duesseldorf.de (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  18. ↑ (Ingelesez) Kramer, M.J.; Grunberg, E.. (1973). «Effect of Ethidium Bromide against Transplantable Tumors in Mice and Rats» Chemotherapy 19 (4): 254–258.  doi:10.1159/000221462. ISSN 1421-9794. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  19. ↑ (Ingelesez) von Wurmb-Schwark, N.; Cavelier, L.; Cortopassi, G.A.. (2006-04). «A low dose of ethidium bromide leads to an increase of total mitochondrial DNA while higher concentrations induce the mtDNA 4997 deletion in a human neuronal cell line» Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 596 (1-2): 57–63.  doi:10.1016/j.mrfmmm.2005.12.003. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  20. ↑ (Ingelesez) Gentry, A. C.; Juul, S.; Veigaard, C.; Knudsen, B. R.; Osheroff, N.. (2011-02-01). «The geometry of DNA supercoils modulates the DNA cleavage activity of human topoisomerase I» Nucleic Acids Research 39 (3): 1014–1022.  doi:10.1093/nar/gkq822. ISSN 0305-1048. PMID 20855291. PMC PMC3035449. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  21. ↑ Redfield, Rosie. Heresy about Ethidium Bromide. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  22. ↑ National Toxicology Program (2005-08-15). "Executive Summary Ethidium Bromide: Evidence for Possible Carcinogenic Activity"(PDF)
  23. ↑ "Executed Summary Ethidium Bromide" (PDF). National Toxicology Program. 2005-08-15. Berreskuratua 2009-09-30.
  24. ↑ (Ingelesez) Hengen, Paul N.. (1994-06). «Methods and reagents» Trends in Biochemical Sciences 19 (6): 257–258.  doi:10.1016/0968-0004(94)90152-X. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  25. ↑ Armour, Margaret-Ann. (2003). Hazardous laboratory chemicals disposal guide. (3rd ed. argitaraldia) Lewis Publishers ISBN 1-56670-567-3. PMC 51258183. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).

Kanpo estekak

[aldatu | aldatu iturburu kodea]