Fils d'un apothicaire, Sebastiano Mainardi collabora jeune à l'atelier florentin de Domenico Ghirlandaio dont il épousa la sœur.
Il travailla surtout à Florence et à San Gimignano, et son style, au-delà de celui de Ghirlandaio, est influencé par la peinture de Verrocchio.
Ses premières œuvres sont les grandes commandes passées à l'atelier de Ghirlandaio : il participa sûrement à la décoration de la Chapelle Sassetti dans la Basilique Santa Trinita (Florence), et de la Chapelle Tornabuoni même si sa main est difficilement reconnaissable entre celle des autres assistants.
En 1485, il travailla au Cénacle du couvent San Marco, où Domenico se limita à dessiner l'ensemble et confia la réalisation à ses assistants, et la plus grande partie de la peinture à son frère Davide Ghirlandaio et à Sebastiano.
Vers 1480 il peignit à San Gimignano une fresque de l'Annonciation, dont le style provient des sujets analogues de Domenico et de David Ghirlandaio, eux-mêmes inspirés de l'Annonciation de Léonard de Vinci des Uffizi. Toujours à San Gimignano il peignit à fresque une série de tympans dans l'Hôpital de Sainte Fine avec les Saints Bartolo, Gimignano, Pietro martyr et Niccolò.
Sa Vierge à l'Enfant, fresque dans la chapelle du Bargello de Florence, date des dernières années du siècle.
Il s'est aussi adonné aux portraits, surtout féminins.
Série de Vierge à l'Enfant (Collection Vittorio Cini de Venise, église des Saints Lorenzo et Martino de Campi Bisenzio, Pinacoteca civique de San Gimignano, au Kunsthistorisches Museum de Vienne, etc.)
Giorgio Vasari le cite dans ses biographies de Le Vite, le nomme Bastiano Mainardi da San Gimignano et retrouve son portrait dans les œuvres de l'atelier du Ghirlandaio. « Il serait un jeune des cheveux longs qui paraît dans la Chapelle Sassetti (San Francesco ressuscita l'enfant) et dans la Chapelle Tornabuoni (Annonce de l'ange à Zaccaria, Expulsion de Gioacchino et peut-être fit-il le modèle pour le jeune ingénu qui attend le baptême dans le Baptême de Christ). »