Séquençage des protéines par spectrométrie de masse

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Le séquençage des protéines par spectrométrie de masse est une technique qui permet le séquençage des protéines par spectrométrie de masse surtout en tandem MS/MS. Elle permet de déterminer la séquence des peptides sur quelques dizaines d'acides aminés. Couplé avec des techniques de digestion (enzymatiques ou chimiques) et avec des techniques de séparation (chromatographie en phase liquide à haute performance par exemple), il est possible de caractériser une protéine.

Principe de la fragmentation

La fragmentation est le processus permettant de séparer chaque acide aminé d'un peptide. Pour des raisons de stabilité des liaisons, les séquences polypeptidiques se clivent préférentiellement au niveau des liaisons peptidiques. Il existe cependant des mécanismes complexes qui produisent d'autres types ruptures de liaison, ce qui peut rendre difficile la lecture des spectres de masses et la détermination de la séquence.

Spectrométrie de masse MS/MS

Pour fragmenter les peptides, on utilise soit plusieurs analyseurs couplés en série (spectromètre de type triple quadripoles QqQ ou de type quadripole-temps de vol Q-TOF) ou un analyseur capable de réaliser plusieurs analyses en série (spectromètre de masse de type trappe ionique IT ou de type résonance cyclotronique FT-ICR).

Le premier analyseur permet de sélectionner un ion à fragmenter (appelé "ion parent") et d'exclure tous les autres ions présents.
Cet ion parent est fragmenté, en général par collision avec un gaz inerte (c'est-à-dire qui ne réagit pas chimiquement avec l'ion parent) dans une cellule de collision. Cette fragmentation permet de "casser" les liaisons moléculaires, en particulier les liaisons peptidiques, et de produire des "ions fils".
Les ions fils sont ensuite séparés par le second analyseur puis détectés.

Mode d'analyse possible

Il existe plusieurs mode d'analyse en spectrométrie de masse en tandem :

Fragment ion scan (ou Product ion scan' ou Daughter scan)

Dans ce mode, un ion parent de rapport m/z donné est sélectionné. Il est fragmenté puis l'ensemble de la gamme de masse est balayée pour analyser les ions fils produits.

Precursor ion scan (ou Parent scan)

Dans ce mode, un seul ion fils de rapport m/z donné est analysé. L'ensemble de la gamme de masse des ions parents est balayé. Ce mode permet d'analyser les ion parents qui produisent spécifiquement un ion fils donné.

Neutral ion scan

Dans ce mode, les ions parents et les ions fils sont analysés sur l'ensemble de la gamme de masse. On choisit un masse m1, on balaye les ions parents sur l'ensemble de la gamme de masse et l'on analyse les ions fils produits de masse m2-m1. Ce mode permet d'étudier les ions parents qui peuvent perdre un fragment neutre (et qui ne peuvent donc pas être analysés par le second balayage). Par exemple, on peut analyser les alcools en recherchant une différence de masse de 18 Da.

Sans balayage

Dans ce mode, la masse de l'ion parent et de l'ion fils est déterminé. Ce mode est utilisé en quantification pour mesurer la quantité d'une molécule donnée.

Type de fragmentation

Les fragmentations peuvent être classées en fonction de leurs types :

Fragmentation spontanée des ions métastables ou fragmentation induite par collision sur une surface (SID Surface Induced Dissociation), avec un gaz inerte (CID Collision Induced Dissociation) ou un gaz réactif (RIM Reactant Ion Monitoring)
Fragmentation de haute énergie (par exemple avec un TOF/TOF), produisant beaucoup de rupture de liaisons, ou fragmentation de basse énergie, minimisant les ruptures de liaisons non peptidiques.

Stabilité des ions

En fonction de l'énergie interne des ions, les ions se fragmentent à différents temps de vie :

ion stable : plus de 10⁻⁶ s
ion métastable : entre 10⁻⁶ et 10⁻⁷ s
ion instable : moins de 10⁻⁷ s

Série de fragmentation

Types de fragmentation a, b, c et x, y, z

M = M(n AA) + M(H) + M(OH)

Code à 1 lettre	Code à 3 lettres	Acide aminé	Masses	Acides aminés modifiés
A	Ala	Alanyl	71	113 (Acétylation) 297 (Biotinylation)
C	Cys	Cystyl	103	160 (Carbamidométhylation) 161(Carboxyméthyl) 174 (Propionamidation) 202 (NIPCAM) 208 (S-pyridyléthylation)
D	Asp	Aspartyl	115	129 (Méthylestérification) 137 (Sodiation)
E	Glu	Glutamyl	129	111 (Pyro-glu) 143 (Méthylestérification) 151 (Sodiation)
F	Phe	Phénylalanyl	147	-
G	Gly	Glycyl	57	-
H	His	Histidyl	137	153 (Oxydation)
I	Ile	Isoleucyl	113	-
K	Lys	Lysyl	128	255 (SMA)
L	Leu	Leucyl	113	-
M	Met	Méthionyl	131	147 (Oxydation) 163 (Sulfonation)
N	Asn	Asparagyl	114	-
P	Pro	Prolyl	97	-
Q	Gln	Glutamyl	128	111 (Pyro-glu en N-term)
R	Arg	Arginyl	156	-
S	Ser	Séryl	87	167 (Phosphorylation)
T	Thr	Thréonyl	101	181 (Phosphorylation)
V	Val	Valyl	99	-
W	Trp	Tryptophanyl	186	206 (Oxydation)
Y	Tyr	Tyrosyl	163	243 (Phosphorylation)

Avec des modifications N-terminales
Modification	Masse
Acétylation	+ 42 Da
Biotinylation	+ 226 Da
Carbamylation	+ 43 Da
Formylation	+ 28 Da
SMA	+ 127 Da

Avec des modifications C-terminales
Modification	Masse
Méthylestérification	+ 14 Da
Sodiation	+ 22 Da

Fragmentation au niveau de la liaison peptidique

Fragmentation d'une seule liaison

Fragmentation N terminale

Série d'ions a

La fragmentation de la série a produit des ions aldimines :

M = M(n AA) + M(H) - M(CO)
  = M(n AA) - 27

La série a* dérive de la série a par la perte d'un groupe NH3 :

M = a - M(NH3)
  = a - 17

La série a⁰ dérive de la série a par la perte d'un groupe H2O :

M = a - M(H2O)
  = a - 18

Série d'ions b

La fragmentation de la série b produit des ions acylium :

M = M(n AA) + M(H)
  = M(n AA) + 1

La série b* dérive de la série b par la perte d'un groupe NH3 :

M = b - M(NH3)
  = b - 17

La série b⁰ dérive de la série b par la perte d'un groupe H2O :

M = b - M(H2O)
  = b - 18

Extrémité N terminale

Le fragment peptidique de plus faible poids moléculaire de la série b correspond à l'extrémité N terminal du peptide parent. Il correspond à la formule :

    R
NH2-CH-CO

et il donne un pic avec un rapport m/z :

m/z = M(H) + M(aa)
    = M(aa) + 1

Extrémité C terminale

Le fragment peptidique de plus haut poids moléculaire de la série b correspond à l'extrémité C terminal du peptide parent [M+H]+. Il correspond à la formule :

         R
NH2-...-(CH)-...-CO

La différence de masse entre ce fragment et le peptide parent correspond donc au dernier acide aminé aan :

m/z = M(ion parent M[M+H]+) - M(fragment peptidique)
    = (M(H) + ΣM(aa) + M(aan + M(OH) + M(H+)) - (M(H) + ΣM(aa))
    = M(aan) + 18

En particulier, dans le cas d'une digestion trypsique, l'acide aminé C terminal correspond à une lysine ou une arginine. En fonction de cet acide aminé, on observe un pic qui apparait aux différence suivante par rapport au rapport m/z de l'ion parent [M+H]+ :

m/z = 146 pour la lysine

et

m/z = 174 pour l'arginine

Série d'ions c

La fragmentation de la série c produit des ions amino :

M = M(n AA) + M(H) + M(NH3)
  = M(n AA) + 18

Fragmentation C terminale

Série d'ions x

La fragmentation de la série x produit des ions acylium :

M = M(n AA) + M(CO) + M(OH)
  = M(n AA) + 45

Série d'ions y

La fragmentation de la série y produit des ions amino :

M = M(n AA) + M(2H) + M(OH)
  = M(n AA) + 19

La série y* dérive de la série y par la perte d'un groupe NH3 :

M = y - M(NH3)
  = y - 17

La série y⁰ dérive de la série y par la perte d'un groupe H2O :

M = y - M(H2O)
  = y - 18

Extrémité C terminale

Le fragment peptidique de plus faible poids moléculaire de la série y correspond à l'extrémité C terminal du peptide parent. Il correspond à la formule :

     R
NH3+-CH-COO

et il donne un pic avec un rapport m/z :

m/z = 2M(H) + M(aa) + M(OH)
    = M(aa) + 19

En particulier, dans le cas d'une digestion trypsique, l'acide aminé C terminal correspond à une lysine ou une arginine. En fonction de cet acide aminé, on observe un pic aux valeurs :

m/z = 147 pour la lysine

et

m/z = 175 pour l'arginine

Extrémité N terminale

Le fragment peptidique de plus haut poids moléculaire de la série y correspond à l'extrémité N terminal du peptide parent. Il correspond à la formule :

          R
NH3+-...-(CH)-...-COO

La différence de masse entre ce fragment et l'ion parent [M+H]+ correspond donc au premier acide aminé aa1 :

m/z = M(ion parent M[M+H]+) - M(fragment peptidique)
    = (M(H) + ΣM(aa) + M(aa1 + M(OH) + M(H+)) - (2M(H) + ΣM(aa) + M(OH))
    = M(aa1)

Série d'ions z

La fragmentation de la série z produit des carbocations :

M = M(n AA) - M(NH) + M(OH)
  = M(n AA) + 2

Fragmentation de deux liaisons

Ion de fragmentation interne

Ces ions correspondent au clivage de deux liaisons peptidiques. Ces clivages correspondent en général à des fragmentations de types b et y et forment des ions amino-acylium :

M = M(n AA) + M(2H)
  = M(n AA) + 2

Parfois, les clivages correspondent à des fragmentations de types a et y et produisent des ions amino-iminium :

M = M(n AA) + M(H) - M(CO)
  = M(n AA) - 27

Ion iminium

Lorsqu'une fragmentation de type a est voisine d'une fragmentation de type y, il se forme un ion iminium :

M = M(AA) + M(H) - M(CO)
  = M(AA) - 27

Les ions immoniums apparaissent dans un spectre MS/MS à des masses inférieurs à 200 Da. Ils permettent de connaître la composition en acide aminé du peptide fragmenté.

Acide aminé	Code à 3 lettres	Code à 1 lettres	Masse	Ion immonium dérivé
Acide aspartique	Asp	D	88	70
Acide glutamique	Glu	E	102	-
Alanine	Ala	A	44	-
Arginine	Arg	R	129	59, 70, 73, 87, 100, 112
Asparagine	Asn	N	87	70
Cystéine	Cys	C	76	-
Glutamine	Gln	Q	101	56, 84, 129
Glycine	Gly	G	30	-
Histidine	His	H	110	82, 121, 123, 138, 166
Isoleucine	Iso	I	86	44, 72
Leucine	Leu	L	86	44, 72
Lysine	Lys	K	101	70, 84, 112, 129
Méthionine	Met	M	104	61
Phénylalanine	Phe	F	120	91
Proline	Pro	P	70	-
Sérine	Ser	S	60	-
Thréonine	Thr	T	74	-
Tryptophane	Trp	W	159	77, 117, 130, 132, 170, 171
Tyrosine	Tyr	Y	136	91, 107
Valine	Val	V	72	41, 55, 69

Fragmentation des chaînes latérales

Série d'ions d

Un ion de la série d est formé par la perte d'une partie de la chaîne latérale de l'acide aminé C terminal d'un ion de la série a.

M = M(AA) + M(H) - M(CO) - M(Rperdu)
  = M(AA) - 27 - M(Rperdu)

Série d'ions v

Un ion de la série v est formé par la perte de la chaîne latérale de l'acide aminé N terminal d'un ion de la série y.

M = M(AA) + M(OH) - M(Rperdu)
  = M(AA) + 17 - M(Rperdu)

Série d'ions w

Un ion de la série w est formé par la perte d'une partie de la chaîne latérale de l'acide aminé N terminal d'un ion de la série z.

M = M(AA) + M(OH) - M(NH) - M(Rperdu)
  = M(AA) + 2 - M(Rperdu)

Liste des modifications des protéines

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