La sua notorietà è legata al ruolo di capo dei banditi ricoperto nel film The Great Train Robbery, del 1903, uno dei primi film ad ambientazione western. Famosa la scena finale del film, dove puntava la pistola direttamente verso la macchina da presa, fingendo di sparare verso gli spettatori.
Figlio di un immigrato scozzese, Justus Barnes aveva alle spalle una lunga carriera teatrale quando nel 1903 apparve in The Great Train Robbery, uno dei primi film americani a enfatizzare la narrazione. Nella memorabile scena finale Barnes, che interpretava il capo dei fuorilegge, puntava la pistola verso la macchina da presa, sparando verso gli spettatori. The Great Train Robbery diventò uno dei film commerciali di maggior successo e più noti dell'era del cinema muto.
Nel luglio 1908 Barnes fu scritturato come attore presso la Edison Manufacturing Company, la società di produzione cinematografica di proprietà di Thomas Edison. Nel 1910 firmò un contratto con la Thanhouser Company a New Rochelle, New York, e tra il 1910 e il 1917 apparve in più di settanta film, di solito nel ruolo di vilain. Inoltre interpretò il personaggio di Ham Peggotty in David Copperfield (1911), il più remoto adattamento cinematografico del romanzo del 1850 di Charles Dickens. Interpretò altri ruoli secondari in Nicholas Nickleby (1912), Aurora Floyd (1912) e A Dog of Flanders (1914).
Nel 1917 fu costretto a lasciare la Thanhouser a causa di problemi finanziari della società e, nello stesso anno, fece un'apparizione per l'Edison Studio in Cy Whittaker's Ward.
Dopo essersi ritirato dalla recitazione, Barnes si trasferì a Weedsport, New York, dove lavorò come commerciante e dove morì il 6 febbraio 1946, all'età di 83 anni.