Krebsov ciklus

Krebsov ciklus ili ciklus limunske kiseline i ciklus trikarboksilnih kiselina (TCA ciklus) je jedan od temeljnih metaboličkih ciklusa u ćelijama koje se koriste kisikom u procesu ćelijskog disanja. Kod aerobnih organizama, ovaj ciklus je integrirajući metabolički proces koji spaja puteve degradacije (katabolizma) ugljikohidrata, lipida (masti) i bjelančevina u ugljik-dioksid i vodu, uz oslobađanje određenih količina hemijske energije.

Ciklus limunske kiseline je anfibolički metabolički put, jer sudjeluje i u degradaciji organskih molekula (katabolizam) i u njihovoj biosintezi (anabolizam). Najvažniji metabolički putevi koji se vežu na Krebsov ciklus su prethodna glikoliza i oksidativna dekarboksilacija piruvata i naredna oksidativna fosforilacija. Krebsov ciklus je važan i kao izvorni oblik pri nastanku aminokiselina (acetil CoA, α-ketoglutarat, sukcinil CoA, sukcinat, fumarat, oksalacetat).

Ciklus nosi ime po Hansu Adolfu Krebsu, britanskom biologu njemačkog porijekla koji je otkrio ključne elemente procesa limunske kiseline i za to dobio Nobelovu nagradu za medicinu 1953.^{[1][2][3][4][5]}

Osnovne reakcije

Krebsov ciklus se odvija u mitohondrijama eukariotskih i citoplazmi prokariotskih ćelija. Katabolizam ugljikohidrata i masti stvara acetil-CoA – molekulu sastavljenu od jedne acetilne grupe koja je vezana na koenzim A. Acetil-CoA je osnovni supstrat Krebsovog ciklusa. Dvije molekule acetil-CoA oslobađaju svoje acetilne grupe, koje se spajaju s oksalacetatom i čine limunsku kiselinu. Ona prolazi kroz niz metaboličkih procesa, oslobađajući dvije molekule ugljendioksida (CO₂) i ponovo se obnavlja u oksalacetat koji je spreman za naredni ciklus. U bioenergetici tog procesa, najbitnije su reakcije stvaranja molekule guanozin trifosfata (GTP), koja odmah obnavlja jednu molekulu adenozin-trifosfata (ATP) i nastanak tri molekule nikotinamid adenin dinukleotida (NADH) i jedne flavin adenin dinukleotida (FADH₂). Ključne hemijske reakcije i uključeni enzimi u Krebsovom ciklusu, kao i njihovi glavni proizvodi prikazani su u tabeli koja slijedi.^[6]

Reducirani kofaktori NADH i FADH₂ su prijelazne molekule u procesima oksidacije i redukcije. U reduciranom obliku prenose elektrone sa oksidiranih molekula iz samog Krebsovog ciklusa i glikolize na molekule prve faze oksidativne fosforilacije, tzv. lanca prijenosa elektrona. Tada se oksidiraju u NAD⁺ i FAD i daju elektrone, koji će se, tokom oksidacijske fosforilacije, iskoristiti za obnavljanje ATP iz adenozin-difosfata (ADP).^[7] –

Konačna stehiometrijska formula svih reakcija je kako slijedi:

${\displaystyle \mathrm {Acetil{\text{-}}CoA+3\ NAD^{+}+FAD+GDP+P_{i}+2\ H_{2}O\longrightarrow 2\ CO_{2}+3\ NADH+3\ H^{+}+FADH_{2}+GTP+CoA{\text{-}}SH} }$

Dobijena energija od potpune razgradnje jedne molekule glukoze, u tri faze ćelijskog disanja (glikoliza, Krebsov ciklus i oksidativna fosforilacija) izbnosi 36 molekula ATP. Ukupno nastaje 38 molekula ATP, ali dvije su iskorištene za prijenos (aktivnim transportom) dviju molekula NADH proizvedenih glikolizom iz citoplazme kroz membranu mitohondrija.

Ciklus limunske kiseline

	Supstrat	Koenzim	Enzim	Vrsta reakcije	Inibitori	Aktivatori	Produkt
1	Oksalacetat	Acetil-CoA, voda	Citrat sintetaza	Kondenzacija	Citrat, NADH, sukcinil-CoA	–	Citrat
2a	Citrat	–	Akonitaza	Dehidracija	–	–	Cis-akonitat, voda
2b	Cis-akonitat	Voda		Hidracija			Izocitrat
3a	Izocitrat	NAD^+	Izocitrat dehidrogenaza	Oksidacija	NADH, ATP	Ca^2+, ADP	Oksalsukcinat, NADH
3b	Oksalsukcinat	H^+		Dekarboksilacija			α-Ketoglutarat, CO2
4	α-Ketoglutarat	NAD^+, CoA-SH	α-Ketoglutarat dehidrogenaza	Oksidativna dekarboksilacija	NADH, sukcinil-CoA	Ca^2+	Sukcinil-CoA, NADH, CO2
5	Sukcinil-CoA	GDP, fosfat	sukcinil-CoA sintetaza	Fosforilacija	–	–	Sukcinat, GTP, CoA-SH
6	Sukcinat	FAD	Sukcinat deihdrogenaza	Oksidacija	–	–	Fumarat, FADH2
7	Fumarat	Voda	Fumaraza	Hidracija	–	–	L-malat
8	L-malat	NAD^+	Malat dehidrogenaza	Oksidacija	–	–	Oksalacetat, NADH

Reakcije u Krebsovom ciklusu

Svaka podjedinica citrat sintetaze veže jednu molekulu oksalacetata (ljubičasto) i jednu acetil-CoA (sivo).

Reakcija 1: Citrat sintetaza

Citratna reakcija oksalacetat-AcCoA: ΔG'°=-31.4 kJ/mol

Struktura akonitaze

Prvi enzim u Krebsovom ciklusu, citrat sintetaza – katalizira reakciju kondenzacije acetil-CoA s oksalacetatom iz kojeg nastaje citrat (limunska kiselina). Enzim ima dvije strukturne podjedinice, od kojih je svaka sposobna vezati oba supstrata za svoje aktivno mjesto.^[1][2][8][9]

Ovaj enzim katalizira aktivaciju acetil-CoA, kako bi se povećala sklonost prema oksalacetatu. Nakon vezanja acetilne skupine za oksalacetat, tioesterna se grupa (CoA) odvaja hidrolizom i oslobađa se limunska kiselina.

Jednadžba reakcije: Acetil-CoA + oksakacetat + H₂O → citrat + CоА + H⁺

Reakcija je vrlo egzoergonska tj. oslobađa energiju (ΔG'°=-31.4 kJ/mol) što sprečava da reakcija teče u suprotnom smjeru. Pored toga, limunska kiselina podešava aktivnosti samog enzima, jer djeluje kao kompetitivni inhibitor. Sposobnost inhibicije citrat sintetaze je veoma bitna za podešavanje cijelog Krebsovog ciklusa, pošto ona djeluje kao biohemijski regulator ritma (pacemaker).^[10]

Reakcija 2: Akonitaza

Reakcija citrat - izocitrat: ΔG'°=+6.3 kJ/mol

Akonitaza katalizira izomerizaciju citrata u izocitrat preko prijelaznog cis-akonitata. Citrat zatim ulazi u proces dehidracije ugljika C3 i stvaranje međuspoja cis-akonitata, koji se zatim hidrira u C2 i stvara izocitrat. Reakcija može teći i povratno − u suprotnom smjeru, ali to se ne događa u Krebsovom ciklusu zbog zakona o djelovanju masa. Koncentracija citrata je 91%, međuspoja cis-akonitata: 3%, a izocitrata: 6%. Reakcija zato teče nepovratno prema izocitratu.

Jednadžba reakcije: citrat → cis-akonitat + H₂O → izocitrat

U aktivnom mjestu akonitaze se nalazi grupa željezo-sumpor koja veže supstrat, zajedno s određenim polarnim aminokiselinama. Prostorna struktura aktivnog mjesta omogućava samo vezanje 1R,2S citrata, odbijajući suprotni izomer.

Struktura izocitrat dehidrogenaze Escherichia coli.

Reakcija 3: Izocitrat dehidrogenaza

Reakcija izocitrat - oksoglutarat: ΔG'°=-8.4 kJ/mol

Mitohondrijska izocitrat dehidrogenaza je enzim koji je ovisan o NAD⁺, Mn²⁺ i/ili Mg²⁺. U početku enzim katalizira oksidaciju izocitrata u oksalsukcinat i, od NAD⁺, proizvodi jednu molekulu NADH. Nakon toga, jedan bivalentni ion (Mn²⁺ ili Mg²⁺) veže kisik iz karboksilne skupine i povećava elektronegativnost tog dijela molekule. Molekulski elektroni se preraspodijele, hemijske veze se kidaju i karboksilne grupe oslobađaju. Dekarboksilacijom se stvaraju α-ketoglutarata i oslobađa jedna molekula CO₂.^[11]

Jednadžba reakcije: izocitrat + NAD⁺ → Oksalsukcinat + NADH + H⁺; Oksalsukcinat → α-ketoglutarat + CO₂

Aktivno mjesto dihidrolipoamid sukciniltransferaze – enzima α-ketoglutarat deihdrogenaze Escherichia coli

Reakcija 4: α-ketoglutarat dehidrogenaza

Reakcija oksoglutarat - sukcinil CoA: ΔG'°=-30.1 kJ/mol

Struktura sukcinil-CoA sintetaze izolirane iz svinjskog srčanog mišića

Transformacija α-ketoglutarata u sukcinil-CoA pomoću α-ketoglutarat dehidrogenaze odvija se putem oksidativne dekarboksilacije. Reakcija uključuje dekarboksilaciju α-ketoglutarata i stvaranje tioesterne veze s koenzimom A, uz konačni proizvod sukcinil CoA i oslobađanje CO₂. Istovremeno se NAD⁺ reducira u NADH.

Jednadžba reakcije: α-ketoglutarat + NAD⁺ + CоА-SH → sukcinil CоА + CO₂ + NADH + H⁺

α-ketoglutarat dehidrogenaza je u biti kompleks sastavljen od tri različita enzima. Podjedinice E1 (2-ketoglutarat dehidrogenaza) i E2 (transsukcinilaza) su vrlo slične podjedinicama u jednom drugom enzimu: piruvat dehidrogenazi. Podjedinica E3, međutim, istovjetna je podjedinici istog enzima. Najvjerovatnije je da jedan enzim evolucijski potiče od drugoga.^[12]

Reakcija 5: Sukcinil CoA sintetaza

Reakcija sukcinil-CoA-sukcinat: ΔG°′ = -3.3 kJ mol^-1

Sukcinil CoA je tioester visoke hemijske energije: njegova ΔG°′ hidrolize je -33.5 kJ mol-1, slična onoj ATP -30.5 kJ mol-1. Enzim sukcinil CoA sintetaza uzima ovu energiju za fosforilaciju purinskog nukleozid difosfata kao GDP u jednoj od ključnih reakcija stvaranja hemijske energije iz Krebsovog ciklusa.

Energija u tioesteru se jednostavno pretvori u energiju fosfatnih veza koje se kasnije koriste kao univerzalni izvor energije u gotovo svim endoergonskim metaboličkim procesima cijelog organizma. U prvom koraku reakcije, enzim iz sukcinil CoA uklanja Koenzim A i nastaje međuspoj visoke energije sukcinil fosfat. Potom jedna molekula histidina prima fosfat u aktivnom mjestu enzima koji oslobađa sukcinat, kao konačni proizvod reakcije i izgradnje fosfohistidina. Fosfohistidin odmah prebacuje fosfat na GDP. pretvarajući ga u GTP. To je jedina reakcija u Krebsovom ciklusu u kojoj se fosforilacija odvija na razini substrata.

Jednadžba reakcije: sukcinat-CоА + Pi + GDP → sukcinat + GTP + CоА-SH

GTP kao molekulu visoke energije (GTP ima ulogu signalne molekule), organizam ne koristi direktno. U Krebsovom ciklusu da posluži kao međuspoj koji prebacuje fosfatnu grupu na ADP kako bi se stvorio ATP. Tu reakciju katalizira enzim nukleozid difosfokinaza.

U završnim fazama Krebsovog ciklusa dolazi do preraspodjele molekula s četiri atoma ugljika do ponovne obnavljanja oksalacetata. Da bi to bilo moguće, metilna grupa na sukcinatu mora proći pretvaranje u karbonilnu grupu, koja se odvija u tri prijelazna koraka: prva oksidacija, hidracija, pa druga oksidacija. Osim što obnavljaju oksalacetat, ovi prijelazi omogućavaju izvlačenje dodatne hemijske energije preko flavin adenin FADH₂ i NADH.

Struktura enzimskog kompleksa sukcinat dehidrogenaze i kompleksa II lanca prijenosa elektrona Escherichia coli

Reakcija 6: Sukcinat dehidrogenaza

Reakcija sukcinat-fumarat: ΔG'°=0 kJ/mol

Struktura fumaraze kvasca Saccharomyces cerevisiae

Prvu reakciju oksidacije katalizira enzimski kompleks sukcinat dehidrogenaze, koji je jedini enzim iz ciklusa sa FAD kao akceptorom vodika, umjesto NAD⁺. FAD je preko jedne molekule histidina kovalentno vezan za enzim, koji rijetko koristi FAD kao primatelja vodika, pošto reakcija ne daje dovoljno slobodne energije da reducira NAD⁺. Enzim katalizira oksidaciju sukcinata u fumarat.

Jednadžba reakcije: sukcinat+ FAD → fumarat + FADH₂

Enzimski sistem sukcinat dehidrogenaze je jedini iz cijelog ciklusa koji se nalazi unutar mitohondrijske membrane, pošto ulazi i u metabolički put lanca prijenosa elektrona (u kojem nosi naziv kompleks II). Nakon prijelaza na FAD, ovaj enzim ubacuje elektrone direktno u lanac prijenosa elektrona, koji je prvi dio oksidativne fosforilacije. To je moguće upravo zbog stabilne veze između enzima i samog kofaktora FAD.

Reakcija 7: Fumaraza

Reakcija fumarat-L-malat: ΔG'°=-3.8 kJ/mol

Struktura malat dehidrogenaze bakterije Thermus flavus

Enzim fumaraza dodaje fumaratu jedan proton i jednu hidroksilnu grupu (OH^-) dobivenu hidrolizom vode i izgrađuje malat kao konačni proizvod. Enzim može vezati grupu OH^- samo sa jedne strane, tako da fumarat prelazi samo u L-malat. Jednačina reakcije: fumarat + H₂O → malat

Reakcija 8: Malat dehidrogenaza

Reakcija L-matlat - oksalacetat: ΔG'°=+29.7 kJ/mol

Posljednja reakcija Krebsovog ciklusa predviđa oksidaciju malata u oksalacetat. Tako se oksalacetat obnavlja i ulazi u novi ciklus putem djelovanja anzima malat dehidrogenaza, koji koristi još jednu molekulu NAD⁺ kao primatelja vodika kako bi proizveo NADH.

Jednačina reakcije: malat + NAD⁺ → oksalacetat + NADH + H⁺

Aktivnost enzima u potpunosti ovisi o potrošnji oksalacetata pomoću citrat sintetaze (prvog enzima u Krebsovom ciklusu) i potrošnji NADH lanca prijenosa elektrona. Stalno smanjenje koncentracije navedenih spojeva pospješuje enzim na stalnu proizvodnju novih spojeva.

Regulacija Krebsovog ciklusa

Brzina hemijskih reakcija u Krebsovom ciklusu podložna je preciznoj regulaciji, srazmjerno energetskim potrebama date ćelije. Ključne tačke kontrole su alosterični enzimi, izocitrat dehidrogenaza i α-ketoglutarat dehidrogenaza.

Isocitrat dehidrogenazu pospješuje prisustvo ADP, koji se veže za enzim i povećava afinitet prema supstratu. Istovremeno vezanje supstrata (isocitrata), NAD⁺, Mg²⁺ i ADP na enzim ima stimulirajući uticaj na aktivaciju, dok NADH i ATP smanjuju njegovu aktivnost, jer zauzimaju aktivno mjesto veze aktivacijskih spojeva (kompetitivna inhibicija).

Slijedeća ključna tačka kontrole je uređivanje aktivnosti α-ketoglutarat dehidrogenaze. Enzim je inhibiran sukcinil-CoA-om i NADH-om, dva konačna proizvoda koji nastaju njegovom sopstvenom aktivnošću. Općenito, enzim može smanjiti aktivnost ako u ćeliji već postoji obilje visokoenergetskih molekula, kao što je ATP. Time se smanjuje uspješnost svih procesa koji proizvode energiju, među kojima Krebsov ciklus ima središnju i čvorišnu ulogu.

Nađeni su dokazi o uređivanju aktivnosti Krebsovog ciklusa i prije njegovog početka, na razinio opskrbe prvog enzima u procesu (citrat sintetaze). Velika koncentracija ATP smanjuje sklonost enzima prema svom osnovnom substratu - acetil-CoA, smanjujući tako proizvodnju citrata. Stoga, što je više ATP u stanici, manja količina acetil-CoA ulazi u sam Krebsov ciklus.^[13]

Veze Krebsovog ciklusa i ostalih metaboličkih puteva

Međudejstvo Krebsovog ciklusa i ostalih metaboličkih puteva

Krebsov ciklus ima čvorišnu ulogu u metabolizmu živih bića, prije svega u katabolizmu organskih molekula, ali i u anabolizmu. Na Krebsov ciklus se nadovezuju različiti metabolički putevi koji, između ostalog, sam ciklus snabdijevaju međuspojevima koji su utrošeni u biosintezi drugih organskih molekula. Te hemijske reakcije se označavaju kao anaplerotičke reakcije.

Prethodni procesi Krebsovog ciklusa

Krebsov ciklus je drugi stepen razgradnje ugljikohidrata. Prvi, glikoliza, razgrađuje glukozu i ostale šećere u pirogrožđanu kiselinu (piruvat), α-ketokiselinu sa tri atoma ugljika. Kod eukariota piruvat se prenosi iz citoplazme u mitohondrije, gdje pod uticajem enzima gubi jedan atom ugljika i nastaje acetil-CoA. Ta se reakcija zove oksidativna dekarboksilacija piruvata, a enzim koji je katelizira je piruvat dehidrogenaza. Prvi substrat u Krebsovom ciklusu je acetil CoA, koji se oslobađa u mitohondrijama.

Kao izvor energije u Krebsovom ciklusu, indirektno služe i bjelančevine i njihovi proizvodi. Bjelančevine se putemproteolize razgrađuju u osnovne građevne jedinice: aminokiseline. Neke od njih, kao aspartat, valin i izoleucin mogu biti direktno pretvoreni u međuspojeve samog ciklusa. Ostale mogu preći u glucide (ugljikohidrate) i uključiti se u ciklus preko metaboličkih puteva karakterističnih za ugljikohidrate.

Proizvodi razgradnje masti su također izuzetno važni izvori energije, koji direktno i indirektno ulaze u Krebsov ciklus. Razgradnju masti kataliziraju enzimi lipaze, koje oslobađaju masne kiseline i glicerol. Glicerol može ući u proces glikolize, osobito u ćelijamajetre ili biti pretvoren u glukozu u procesu glukoneogeneze. U mnogim tkivima, pogotovo srcu, masne kiseline se razgrađuju tokom procesa beta oksidacije koja direktno proizvodi acetil CoA: osnovni supstrat Krebsovog ciklusa. Beta oksidacija može proizvesti i propionil CoA, koji se putem glukoneogeneze pretvara u glukozu.

Procesi iza Krebsovog ciklusa

Osnovni proces koji slijedi Krebsov ciklus je oksidativna fosforilacija, metabolički put u kojem završava ćelijsko disanje. Glavna uloga te fosforilacije je oksidacija kofaktora NADH i FADH₂, koji ponovo u oksidiranom obliku ulaze u Krebsov ciklus NAD⁺ i FAD. Ovaj proces generira gradijent protona i elektrona, čija se energija koristi za proces fosforilacije molekula ADP u visokoenergetske molekule ATP. U tom se procesu protoni (H⁺) vežu na kisik, kojeg organizmi unose iz atmosfere i stvaraju vodu kao konačni proizvod. Oksidacijska fosforilacija, koja je relativno niska u Krebsovom ciklusu, uveliko povećava uspjeešnost proizvodnje visokoenergetskih nukleozida, kao što su ATP i GTP.

Procesi koji koriste međuspojeve Krebsovog ciklusa

Međuspojevi Krebsovog ciklusa ulaze u mnoge druge metaboličke puteve. U popis koji slijedi, uključeni su metaboliti Krebsovog ciklusa i metabolički putevi u kojima sudjeluju.

• Acetil CoA:
  • Beta oksidacija
  • Biosinteza masnih kiselina;
  • Degradacija lizina
  • Degradacija valina i izoleucina
  • Metabolizam fenilalanina
• α-ketoglutarat:
  • Biosinteza lizina
  • Metabolizam askorbinske kiseline
  • Metabolizam glutamata
• Sukcinil CoA:
  • Metabolizam propanoata
  • Biosinteza porfirina
  • Degradacija leucina i izoleucina
  • Metabolizam fenilalanina
• Sukcinat:
  • Metabolizam butanoata
  • Metabolizam tirozina
• Fumarat:
  • Ciklus ureje
  • Metabolizam arginina i prolina
  • Metabolizam tirozina
• Oksalacetat:
  • Glukoneogeneza
  • Metabolizam glutamata i aspartata
  • Metabolizam glikoksilne kiseline

Mapa interaktivnih puteva

Šablon:TCACycle WP78

Također pogledajte

• Calvinov ciklus
• Metabolizam
• Anabolizam
• Katabolizam

Reference

1. Hall J. E., Guyton A. C. (2006): Textbook of medical physiology, 11th edition. Elsevier Saunders, St. Louis, Mo, ISBN 0-7216-0240-1.
2. Međedović S., Maslić E., Hadžiselimović R. (2000): Biologija 2. Svjetlost, Sarajevo, ISBN 9958-10-222-6.
3. Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.
4. Kornberg A. (1989): For the love of enzymes – The Odyssay of a biochemist. Harvard University Press, Cambridge (Mass.), London,ISBN 0-674-30775-5, ISBN 0-674-30776-3.
5. Hunter G. K. (2000): Vital Forces. The discovery of the molecular basis of life. Academic Press, London 2000, ISBN 0-12-361811-8.
6. Barnes S. J., Weitzman P. D. (1986): Organization of citric acid cycle enzymes into a multienzyme cluster. FEBS Lett., 201 (2): 267–270.
7. Berg J. M., Tymoczko J. L., Stryer L. (2002): Biochemistry, 5th edition. W. H. Freeman and Company, ISBN 978-0-7167-4684-3.
8. Nelson D. L., Cox M. M. (2013): Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman and Co., ISBN 978-1-4641-0962-1.
9. Kapur Pojskić L., Ed. (2014): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 978-9958-9344-8-3.
10. Usher C, Remington J., Martin P., Drueckhammer G. (1994): A very short hydrogen bond provides only moderate stabilization of an enzyme-inhibitor complex of citrate synthase. Biochemistry 33, S. 7753.-7759.
11. Mesecar A.D., Stoddard B.L., Koshland Jr. D.E. (1997): Orbital steering in the catalytic power of enzymes: small structural changes with large catalytic consequences. Science v, 277: 202-206.
12. Knapp J. E. et al. (2000): Expression, purification, and structural analysis of the trimeric form of the catalytic domain of the Escherichia coli dihydrolipoamide succinyltransferase. Protein Sci. v 9. 37-48.
13. Voet D., Voet J. G. (2004): Biochemistry, 3rdedition. John Wiley & Sons, Inc., New York.

Vanjski linkovi

• Citric acid cycle Animation(flash required)
• An animation of the citric acid cycle at Smith College
• Notes on citric acid cycle Arhivirano 22. 5. 2008. na Wayback Machine at rahulgladwin.com
• Citric acid cycle variants at MetaCyc
• Pathways connected to the citric acid cycle Arhivirano 26. 10. 2008. na Wayback Machine at KEGG|Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
• A more detailed tutorial animation Arhivirano 25. 6. 2005. na Wayback Machine at johnkyrk.com
• A citric-acid cycle self quiz flash applet Arhivirano 6. 7. 2008. na Wayback Machine at University of Pittsburgh
• The chemical logic behind the citric acid cycle